糖尿病患者ecfc和高糖高脂诱导下huvec+slit2frobo表达的变化

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1、万方数据2．1．2试剂来源及配置⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．1．3实验仪器及设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．192．2．1细胞培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2．2细胞分组⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．2．3提取细胞RNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．202．2．4细胞RNA逆转录为eDNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．202．2．5Slit2／3、Robol／4基

2、因的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．2．6Westernblot检测Slit2／3、Robol／4蛋白的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯212．2．7统计分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．1高糖诱导下HUVECSlit／RobomRNA表达的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．243．2高糖诱导下HUVECSlit／Robo蛋白水平表达的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．273．3高脂诱导下HUVECSlit／RobomRNA表达的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．304讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯335结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。40攻读学位期间主要研究成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。48致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一49VⅡ万方数据符号说明VIII万方数据硕士学位论文前言．二l

4、JL．·-J-_刖罱随着我国经济和社会的发展，2型糖尿病在我国的发病率急剧升高，而且发病年龄有逐渐年轻化的趋势。糖尿病常见的慢性并发症之一是糖尿病血管病变，其中，糖尿病下肢血管病变已经成为糖尿病患者致残致死的重要原因。高糖状态、高脂血症和胰岛素抵抗等因素均可损伤血管内皮细胞，引起血管内皮细胞功能障碍，从而诱发糖尿病血管病变的发生和发展。因此，如何对其进行有效预防和治疗，一直是临床工作者面临的重要问题之一。Slit家族是一类分泌性糖蛋白，由发育期中线的神经胶质细胞和中隔组织分泌，通过结合神经细胞膜上的roundabout(Robo)受体家族发挥神经导向因子作用【11。目前已经发现

5、3种同源Slit蛋白在脊椎动物表达，即Slitl、Slit2、Slit3，主要分布于神经、肾、肺、脑、心脏、脾、淋巴结、卵巢、肿瘤组织及血管内皮等，Robo为Slit蛋白的受体，是一种单次跨膜蛋白，在哺乳动物中包括4个成员：Robol、Rob02、Rob03、Rob04，主要表达于神经系统中，也表达于神经系统以外的组织细胞中，如血管内皮细胞[21，提示Robo在非神经组织细胞中可能也存在重要的生物学功能。有研究表明，Slit／Robo除了作为神经轴突导向生长因子在神经系统的正常发育中具有导向轴突生长和排斥神经细胞迁移的功能外，还具有调节血管内皮细胞迁移和促进血管新生的重要作用。

6、Slit／Robo调节血管新生的生物学功能主要是Slit的第二个富含亮氨酸序列结合于Robo受体细胞膜外区域的IGl及IG2区段，实现Slit／Robo配体与受体的相互作用岬1，并通过其受体的细胞内区域，实现细胞质内其他信号因子的激活，GTP酶的Rho家族包括Rho、Rac、Cdc42等在内的因子均可调节其下游信号因子，从而对细胞骨架进行调节，介导形成细胞伪足，调节细胞的定向迁移活动等生物学功能[5-6]。有研究提示，Robol和Rob04是参与血管新生过程的主要受体，如Wang[21等报道，Slit2蛋白能以浓度依赖的方式，通过作用于Robol，吸引内皮细胞，促进内皮细胞定向

7、迁移和在细胞外基质上促进血管样结构的形成。Slit3也可作为有效的促血管因子，通过作用于Rob04而不是Robol受体，增强血管内皮细胞的增殖、迁移和趋化性，加速内皮细胞血管样网络结构的形成，进一步研究发现，S1掐与Rob04相互作用能激活RhoGTP酶信号通路，包括Racl和RhoA的激活，可导致细胞骨架重排和细胞极性改变，在体内和体外研究模型中促进血管内皮细胞的迁移和血管样小管结构的形成【7J。糖尿病血管病变的早期改变是血管内皮细胞的结构损伤和功能失调，研究表明，内皮祖细胞(endoth