hcv—肝细胞肝癌精氨酸酶通路的研究

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1、上海交通大学医学院博E学位论文HCV一肝细胞肝癌的精氨酸酶通路研究摘要本论文主要研究丙型病毒性肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)感染后，宿主肝细胞内精氨酸酶(arginase，ARG)的表达是否发生变化，以及ARG表达对肝细胞生长的意义和机制。研究分为三部分：第一部分以蛋白印迹和免疫组化技术分析Huh7．HCV细胞和HCV-HCC组织中ARGl和ARG2的表达，并测定细胞生长情况。研究发现，HCV-HCC组织肝癌细胞和Huh7．HCV细胞中ARGl和ARG2的表达均被明显上调，HCV阳性细胞较对

2、照细胞具有显著的生长优势。，第二部分首先采用ARGl特异的siRNA方法抑制Huh7．HCV细胞的ARGl的表达(实验组)，同时以不针对任何已知基因的siRNA作实验对照(对照组)，观察细胞生长的变化。结果显示，干扰ARGl后实验组肝细胞的ARGl表达被明显抑制，而对照组ARGl表达未受明显影响。相应地，实验组细胞生长速率明显减缓，部分肝细胞死亡，提示ARGl表达被上调是HCV促进肝癌细胞生长的重要原因。我们对干扰ARGl后一氧化氮合酶．2(nitricoxidesynthase．2．NOS．2)的表达及NO浓

3、度进行检测，并以流式细胞术分析细胞周期，结果显示，抑制ARGl表达后NOS．2被上调且NO浓度升高，细胞周期发生变化，提示ARG通路参与上淘交通大学医学院博士学位论文HCV促进肝细胞生长的机制。第三部分我们以HepG2．HCV细胞注射裸鼠皮下组织后，观察HCV对裸鼠体内肿瘤形成和小鼠生存的影响，并对实验肿瘤进行病理学分析，以实时RT-PCR技术检Nd,鼠肿瘤组织、肝组织和肺组织中是否存在病毒核酸，并采用免疫组化技术对肿瘤中ARGl和NOS．2的细胞定位和表达进行分析。结果显示，与对照细胞相比，HepG2．HCV

4、细胞注射裸鼠后形成肿瘤的小鼠比例高、肿瘤体积大、荷瘤小鼠生存期短。注射了HepG2．HCV细胞所形成的皮下肿瘤组织表现出与HCV-HCC相似的病理学改变。另外，小鼠肝脏中肝细胞发生类似急性肝炎的变化。肝脏和肿瘤组织中检测到HCV-RNA。本研究初步建立了HCV感染及HCV-HCC的小鼠模型。研究显示，ARG通路可能参与了HCV感染导致的原发性肝细胞肝癌的发病机制。关键词：肝炎病毒，丙型，肝细胞肝癌，精氨酸酶，一氧化氮合酶，一氧化氮上海交通大学医学院博L学位论文中文详细摘要精氨酸是人体所需的半必需氨基酸，机体在一

5、般代谢状态下精氨酸的需要量可由体内合成并供应，而在生长迅速的组织和细胞中必须由外源营养途径提供。在绝大多数肿瘤细胞的生长中，精氨酸是一种必需氨基酸。肝癌细胞的快速生长同样依赖外源精氨酸的存在。向体外培养的肿瘤细胞中加入合成精氨酸的底物或其他氨基酸和营养物质均不能纠正去精氨酸对肿瘤细胞造成的生长抑制状态，说明精氨酸的作用具有不可替代性，精氨酸对肿瘤细胞生长的作用不是单纯作为合成代谢的原料或作为能量物质，可能具有更重要的意义。由于精氨酸是精氨酸一精氨酸酶一一氧化氮合酶一一氧化氮通路(以下简称ARG通路)的重要组成部

6、分，丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus，HCV)可能通过直接或间接地影响该通路调节肝细胞的中间代谢，使肝细胞的中间代谢出现严重障碍，引起肝细胞的代谢紊乱和生长失控，导致细胞病变。研究发现，体内存在两种类型的精氨酸酶(Arginase，ARGl和ARG2)，具有相同的催化作用，但在染色体定位及表达部位等方面有所不同。ARGl主要在肝细胞表达，正常时表达处于稳定的基础水平，ARG2在肾脏和红细胞表达为主。Feitelson博士等以基因芯片研究HCV感染肝癌细胞的表达谱变化，发现二种ARG在HCV阳性肝细胞

7、内表达均被上调，且很多重要代谢酶也发生改变，表明HCV改造了肝细胞的代谢基因表达谱，这些变化涉及所有三大类营养物质的代谢酶。HCV阳性肝细胞的代谢发生显著变化并表现出的代谢异常可能与此密切相关。ARG通过尿素循环催化底物L．精氨酸生成尿素，是体内氨基酸代谢产物排出体外的方式，机体通过该循环保持氮平衡。由于肿瘤细胞的代谢加速，更多的代谢废物需要排出肿瘤细胞以使其维持高速生长，ARG的表达上调正好可满足这一需求。此外，ARG参与多胺代谢，是其合成步骤中一个重要的代谢酶。多胺主要包括腐胺、精胺和精脒等，是细胞生长必需

8、的促进因子，多胺合成增加使肿瘤细胞拥有充足的代谢原料，促进瘤细胞的生长，反之，瘤细胞因代谢物缺乏则生长被抑制。从这一角度看，ARG表达增加可lO上海交通大学医学院博：lj学位论文能具有促进细胞生长的作用，若干扰ARG的转录和表达或抑制其正常功能的发挥则可能影响肝细胞的代谢并进一步减缓其生长。另一方面，ARG与一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)共用底物L．精氨