卤代甲烷甲基转移酶基因转化烟草的研究及中华补血草lsnhxs基因的功能研究

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1、山东师范大学博士论文卤代甲烷甲基转移酶基因转化烟草的研究及中华补血草三小暧骼基因的功能研究(山东师范大学生命科学学院，济南，250014)中文摘要第一章卤代甲烷甲基转移酶基因转化烟草的研究’甲基溴是在全球被广泛采用的一种熏蒸杀虫剂，但是，甲基溴对臭氧层和环境有破坏作用。国际组织呼吁尽快淘汰甲基溴，因此，甲基溴替代技术的开发迫在眉睫。卤代甲烷的生物合成由以下酶促反应完成：S』蝴(S．腺苷甲硫氨酸)+X。(C1。，Br_，r)一CH3X+S．adenosylhomocysteiIle(S．腺苷高半胱氨酸)，反应由一种甲基转移酶(metIlylchloridetrallsferaseMC

2、T)催化完成。本实验克隆了来源于甜土植物一拟南芥及来源于盐生植物一盐芥和盐地碱蓬的们瑾因彳￡^犯r(彳倒C屺)、砌MCr和&^犯丁。通过基因工程手段将这三个基因转入烟草，实现基因的过量表达。土壤甲基溴熏蒸的目标在于杀死具有较高耐药性的病源物的孢子或其他休眠形式，熏蒸所需浓度高，这也是造成环境污染的原因。通过转基因手段，赋予转基因烟草微量、持续产生甲基溴的能力，病源物侵染时可直接对其作用，从而替代甲基溴土壤熏蒸。此技术在国内外尚属首创。主要实验结果如下：1)利用RT．PCR和RACE方法克隆获得乃J们丁和燃丁基因的全长序列。乃们r基因全长923bp，开放阅读框为68lbp，共编码22

3、6个氨基酸，蛋白分子量约为25．1KD。&肘Cr基因全长1094bp，开放阅读框为699bp，共编码232个氨基酸，蛋白分子量约为25．8KD。2)将彳饥纪几砌们丁和蝴r的全长ORF构建到植物双元表达载体p玳T4中，用农杆菌介导的叶圆盘法转化烟草，分别获得了18个彳f加兀20个乃MCr和38个．5：，^纪z’基因独立的转化株系。3)对转基因植株进行分子鉴定。PCR分析、Soutll锄和No础em杂交结果表明外源基因已整合进烟草的基因组中并正常转录。用总蛋白作W色Stem杂交，三种转基因植株均有杂交信号。但是如果主要用可溶性蛋白作w色st锄杂交，则只有彳棚Cr转基因植株有杂交信号，而

4、刀l埘丁和燃丁转基因植株均没有杂交信号。山东师范大学博士论文4)用不同浓度的处理液处理野生型和转基因烟草，用气／质联用仪测定其CH3C1、CH3Br和CH3I的释放量。彳纨纪丁转基因植株a12三种气体的释放量明显高于野生型对照，是对照的100倍左右，而砀脚和。弧^纪71转基因植株的释放量和对照差异不明显。5)对彳m纪丁转基因植株a12和野生型植株接种线虫，在施加Br．，增加底物的情况下，彳饥纪丁转基因植株提高了对线虫的抗性。第二章中华补血草工小憾骼基因的功能研究液泡膜N棚逆向转运蛋白与植物耐逆密切相关，它利用液泡膜H+一ATPaSe及一一PPase泵H+产生的驱动力把Na+区隔化入

5、液泡中以消除Nr的毒害，除此之外，液泡膜Na+／H十逆向转运蛋白还与PH调节、囊泡运输、液泡的发育以及蛋白质分选有关。液泡不仅是一个物质储存细胞器，在特定的生理条件下，某些植物细胞的液泡可参与矿质离子、简单糖类、有机酸和氨基酸等物质的运输。早期的电镜观察发现，补血草盐腺分泌细胞内有大量的线粒体和丰富的内质网，缺少清晰的中央大液泡，但细胞内有许多液泡样的小囊泡，小囊泡大部分都靠近细胞质膜且经常出现与质膜的融合，推测囊泡运输参与了补血草的泌盐过程。由此推测补血草液泡膜Na+爪+逆向转运蛋白LsNHXs将对补血草的泌盐产生一定的影响。因此，本实验克隆了厶麟基因，并利用RN～技术对其功能进

6、行了研究。主要实验结果如下：1)采用RT．PCR和3’姒CE方法从补血草中克隆获得上训咒骼基因家族三个成员三小睨肼、三s脚和厶心的保守区序列以及L小假勉和三s脚的3’端特异序列。2)构建植物基因IⅢAi沉默表达载体并转化补血草，获得三个单基因和一个双基因的IⅢAi沉默表达植株，快繁转基因植株供分子鉴定和耐逆分析。3)厶脚转基因植株叶片表面分泌物中的N矿、K+离子含量比野生型对照显著增加；叶组织内Nr离子含量和K+离子含量均略高，但差异不显著；K+／Na+比没有显著差异。4)工小懈汜转基因植株叶片表面分泌物中的N矿离子含量比野生型对照有所下降，但差异不显著；《离子含量比对照显著降低。

7、厶脚转基因植株叶组织内Na+离子含量略高，但差异不显著；K+离子含量和C／Na十比均降低。5)厶心转基因植株叶片表面分泌物中的Na+离子含量比对照增加，但差异不显著，K+离子含量比对照增加，在400111]MNaCl条件下达到显著差异；叶组织内Na+离子2山东师范大学博士论文含量和K_离子含量均略高；K+／Na+比没有显著差异。6)Z￡舰Z7+￡s凇双基因沉默植株叶片表面分泌物中的Na+离子含量比野生型对照增加，K+离子含量与野生型对照相比没有显著差异。转基因植株叶中