中华补血草遗传转化体系的建立及补血草nkcc基因沉默的功能研究

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1、山东师范大学硕士学位论文中华补血草遗传转化体系的建立及补血草NKCC基因沉默的功能研究姓名：张霞申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：赵彦修;张慧20080420独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得(注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空)或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者筘名：张霞导师签字：学位论文版权使用授权书遗云钟本学

2、位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权—堂圭L可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学雠文储躲张馁新搏交易纠签字日期：2008年4月20同签字日期：2008年4月20R山东师范大学硕士学位论文中华补血草遗传撇系的龟芷及补血草艘基因沉默的功能研究张霞(山东师范大学生命科学学院，济南，250014)中文摘要许多环境因子会对植物的生长产生胁迫影响，是植物生长的胁迫因子。植物生长

3、发育过程中不可避免地会受到(环境)胁迫因子的影响。重度的胁迫会对植物的生长发育造成伤害；在农业生产中则会降低农作物的产量、质量和经济效益。研究植物对胁迫的应答及调控机理对降低胁迫的不利影响，指导农业生产具有积极的意义。高盐是常见的胁迫因子，土壤盐渍化会严重抑制植物的生长和发育，影响农作物的品质和产量。盐对植物造成的胁迫同植物的离子运输密切相关，因此，研究植物的离子运输对理解植物耐盐的机理及调节至关重要。动物中的研究表明，NKcC是一类与盐腺泌盐功能密切相关的离子转运结构，它同C1．-．Channel(氯离子通道)以及该基因家族的其它成员的编码产物如KCC、NCC协同配合对动

4、物盐腺的泌盐功能至关重要。在植物中，泌盐是盐生植物耐盐的一种重要策略，但分子水平上对植物泌盐的机理还了解甚少。因此，在植物，特别是在盐生植物中，M(CC的研究对理解植物的泌盐机理，了解动植物中类似基因的功能具有一定的意义。中华补血革仁i州彻f“ms加绷sPKuntzc)为白花丹科(Pmm6昭Pn口c∞0补血草属(三f研鲫m朋)多年生泌盐草本植物。它具有特殊的泌盐结构一盐腺，可将吸收到体内的盐离子排到体外，从而避免盐分胁迫的伤害。中华补血草可以使盐土脱盐，改善土壤结构，被誉为盐碱地改造的”先锋植物”。中华补血草是一种鲜切花栽培种，又是理想的天然干花材料，俗称“星辰花”、勿忘我

5、”，在世界许多地区商业栽培。但中华补血草具有大量的不孕枝，同时又具有同型杂交不孕的特性，种子结实少，限制了专业化生产的发展，可以考虑利用转基因技术来改良补血草品种。通过对补血草赫腺泌盐过程和泌盐机理的研究，盐腺的形态构造及其泌盐过程和规律已有初步了解，但是中华补血草之所以具有较高抗盐能力的关键因子是什么?至今还不太清楚。要研究该问题，基因敲除或RNAi技术无疑是强有力的工具，这就需要建立中华补血草的高效遗传转化体系。本研究是在已建立的中华补血草再生体系的基础上，对农杆菌介导的中华补血草叶圆盘转化体系中各相关影响因子进行了实验研究，研究发现：山东师范人学硕士学位论文1)补血草

6、叶片对卡那霉素是敏感的。50m∥L的卡那霉素浓度作为补血草叶片转化受体的筛选浓度比较适宜。2)头孢曲松钠和特美汀的抑菌效果不同。400IIl∥L的特美汀就能有效抑菌，三到四周转接一次即·叮，且不影响外植体的分化，既减少了工作量，又提高了转化率。3)接种EHAl05菌株时，补血草的转化率远远高于接种LBA4404和GV3101菌株，可达15％。4)对于长至llcm左右的补血草无菌苗叶片，侵染时重悬菌液浓度以OD600=0．7．1．O为宜，转化率可达15％。513d和4d共培养天数的处理对补血草转化率的影响不大，以4d的共培养效果稍好，有15％的外植体可以分化出芽。本试验中构建

7、了^wcc基因的沉默载体，并实现了对中华补血草的遗传转化，获得了转基因植株，并得到了分子证据。转基因植株的分子生物学检测如下：1)各转基因株系中，均能通过PcR扩增出nptII基因795bp的特异性条带，初步表明印tII外源基因已整合到受体植物基因组中。21Southcm杂交结果进一步证实外源基因已整合到补血草的基因组中。31RealtimePcR结果显示，随机选取的叫个转基因株系的Ⅳ嬲c转录水平会发生不同程度的下降。进一步说明A0rCC基因的反向重复片段整合到奉卜血草的基因组后已正常转录，并引起了M犯CRNA的降