雷米普利抑制瘢痕形成的分析

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1、万方数据浙江大学硕士学位论文绪论中表达缺失。在创面愈合的不同阶段，ACE在mRNA水平的表达明显增加，且在3例创面愈合后三个月的浅表瘢痕中，应用免疫组织化学的方法证实在真皮组织中ACE表达明显5。以往的关于ACE在伤口愈合和瘢痕形成的研究表明血管紧张素酶抑制剂(angiotensinconvertingenzymeinhibitors，ACEI)的口服和局部应用能显著改善瘢痕6。但这些研究主要局限于ACE在RAS中对AnglI的作用，对ACE自身功能多样性的认识尤其不足，ACE在瘢痕形成中的作用机制尚不明确。本实验为国家自然科学基金项目“血管紧张素转换酶

2、对皮肤瘢痕形成的调控作用和机制研究”的一部分，旨在通过制作大鼠线状皮肤瘢痕模型，观察其在给予不同药物时瘢痕形成情况并检测相关蛋白和活性肽，验证ACE在体内对瘢痕形成的影响。2万方数据浙江大学硕士学位论文实验材料2实验材料2．1主要实验仪器CKX41SF倒置相差显微镜TDL5M离心机HFanfe一1500生物安全柜3111．REL二氧化碳恒温培养箱DKS．12电热恒温水槽移液器荧光定量PCR仪荧光显微镜Mini-PROTEAN垂直电泳和转膜系统样品匀浆快速制备系统Infinitem200系列多功能酶标仪漩涡混合器2．2主要实验试剂明胶海绵DMEM培养基(高

3、糖)胎牛血清胰蛋白酶10％预制胶RNAisoPlus总RNA提取试剂盒逆转录试剂盒SYBR⑧PremixExTaqTM(PerfectRealTime)PVDF膜0L～口US公司Sigma公司HealForce公司ThermoForma公司杭州蓝天化验仪器Eppendorf公司ABI公司OIYⅣ田US公司BIO．RAD公司MP公司Tecan公司Thermo公司Gibco公司Gibico公司Invitrogen公司Takara公司TaKaRa公司Millipore公司3万方数据浙江大学硕士学位论文实验材料4PageRule—PlusPrestainedPr

4、oteinLadder(10．250kDa)Fermentas公司TGF-BRII抗体美国CST公司ACE抗体美国R&D公司p-Smad3抗体美国R&D公司p-TAKl抗体美国SCT公司抗胶原I抗体美国SigrnaJ公抗胶原III抗体美国Sigma公司内参GAPDH抗体美国CST公司ACE引物上海生工生物公司TGF一131引物上海生工生物公司Smad3引物上海生工生物公司TAKl引物上海生5-生物公司I型胶原引物上海生212生物公司IⅡ型胶原引物上海生212生物公司羊抗鼠IgG．HRP(二抗)美国Pierce公司羊抗兔IgG—HRP(二抗)美国Pierc

5、e公司BCA定量试剂盒达文科技有限公司sD大鼠浙江大学紫金港动物实验中心提供万方数据浙江大学硕士学位论文实验方法3实验方法3．1明胶海绵置入法建立大鼠皮肤切口癜痕模型大鼠背部瘢痕模型参照刘伟等7的方法。选取体重2259左右雄性SD大鼠24只。大鼠背部脱毛，在鼠背中部距正中1．5cm处设计平行于大鼠长轴的对称矩形切口，切口大小3cm×0．3cm，切除包括肉膜在内的大鼠皮肤全层，切口内置入3cm×4mm×5mm的明胶海绵，3cmx4mm的面向下，如图一。图一设计3cm×3mm矩形切口(a)，切除包括肉膜在内的皮肤全层，将3cmx4mm×5mm的明胶海绵置入切

6、口内24只大鼠分为四个组。雷米普利组6只，按每只大鼠每日8mg／kg的量，饮水给予ACEI药物雷米普利作为实验组。氯沙坦组6只，按每只大鼠每天50mg／kg的量通过饮水给予氯沙坦作为阳性对照组。肼苯哒嗪对照组6只，按每只大鼠每天40mg／kg的量用水给予肼苯哒嗪作为低血压对照组。空白对照组6只给予普通洁净饮水。万方数据浙江大学硕士学位论文实验方法术后2天起，隔天观察大鼠创面愈合和瘢痕形成情况，记录创面(瘢痕)中部宽度。术后14天处死大鼠，切取瘢痕中部约5mm石蜡包埋后切成59m的切片，分别做HE染色和Masson染色观察瘢痕宽度和胶原形成。其余瘢痕用于荧

7、光定量PCR及WestemBlot检测。3．2大鼠皮肤瘢痕组织切片测量瘢痕宽度和面积HE染色后，在倒置相差显微镜下拍照，并用Image．ProPlus软件测量各切片的瘢痕宽度和面积，用于统计分析。瘢痕宽度取瘢痕在皮肤表面的相对宽度，瘢痕面积为表皮以下肉膜以上的相对瘢痕面积(图二)，均由计算机自动显示相对面积。垒!塑蓐嫩躐i髓㈤嬲嘲麟嬲—隧豳豳■■■—●—■—■■■霸啊豳●—睡}lt帮曼堂熙如!鬻黧!，。撼黪蔓篓黧¨⋯壁黧懋，。慧：慧麓冀黧懋曼。、．一．，。o．。。。鑫曰鞠孙℃誉■国；2l教口0岛镑矿；q毒氍；懈滥科{苍珏瓣鸶“§i国强磺图二运用Image

8、．ProPlus软件中的循迹工具，手动框定瘢痕区域。选好的瘢痕区域如图所示。3．