灌注法制备大鼠及家兔全肾脏脱细胞基质的研究

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1、硕士学位论文灌注法制备大鼠及家兔全肾脏脱细胞基质的研究硕士研究生：刘思然指导教师：刘春晓教授摘要组织工程学是一门近年来新兴的综合性学科，是一门运用细胞、工程材料学方法和创j?i适当生化、理化因素，以改善或替代组织的生物学功能的学科，是人类治疗组织、器官的功能衰竭和缺失的研究方向。其基本原理和方法是令少量组织细胞通过体外培养扩增达到一定数量后，接种到具有一定空间结构的支架上，构成有生命活力的细胞支架复合物，并移植到体内，以达到修复或替代组织损伤的目的。近年来，组织工程学有了迅猛的发展，对多种组织均有相应的组织工程器官面世的报道，如骨、软骨、血管、膀胱等，尤其在泌尿系统组织工

2、程学上，国外学者更已将组织工程膀胱投入临床试验，成为首个植入人体内的真正意义上的组织工程人造器官。它既为众多研究者们建立了典范，同时也开启了更为广阔的未知领域：是否所有的人体组织均能通过组织工程学的方法创造出人造器官?然而由于人体各器官结构、功能、代谢环境各异，如何在现有科学水平下成功制备并植入具有正常代谢及功能的器官，仍有许多难题留待研究者们克服。研究背景器官或组织的功能衰竭和缺失，是严重危害人类健康的最为常见的疾病。人类尝试利用各种替代材料进行器官或组织的替代修复，取得了相当的进展。在泌尿系统，膀胱、尿道、输尿管等器官除了已有常规的自体组织移植手术方法，也有其它材料的

3、替代手段，如对于膀胱可用肠代膀胱，也有组织工程膀胱中文摘要的报道。然而对于慢性肾脏功能衰竭的患者，或肾肿瘤、肾外伤的独肾患者，目前的治疗手段仅限于透析或异体肾移植。前者费用高昂且并非根治手段，对患者及其家庭造成沉重负担；后者除费用高昂外，还受肾源短缺、术后长期使用免疫抑制剂等因素限制而不能对每个患者实施。截至本研究完成前，国内外尚未有组织工程肾体外构建成功的案例，并且学者们的研究重点均在于如何体外培育肾细胞，而合适的细胞支架则一直鲜有提及。本研究实验从寻找合适的细胞支架的角度出发，希望通过制备无细胞的、生物相容性及降解性良好的细胞支架，为构建组织工程肾打下基础。研究目的1

4、．探讨灌注法制备大鼠的全肾脏脱细胞基质(ACM)支架的条件和方法。通过对多种细胞支架的比较发现，脱细胞基质(AcellularMatrix)是一种良好的细胞支架。它具有原组织的宏观及微观结构，并且富含胶原、弹力纤维，并含微纤维蛋白、纤维结合素、层粘连蛋白、蛋白多糖、透明质酸、硫酸软骨素等。经脱细胞后留下的细胞外基质成分具有良好的生物相容性，并且各种组成的成分分别携带或接收不同的信号，诱导不同的细胞，因而对于细胞类型中基因表达方式，细胞的粘附、移行、转移等都有极重要的影响。目前制备脱细胞基质的方法基本局限予以酶或去污剂浸泡洗脱，而对实质性脏器基本无法达到脱细胞的目的。本研究

5、以去污剂为洗脱细胞的溶剂，引入灌注法，通过血管、肾小球、肾小管这一自然平台达到将肾脏内部细胞洗脱的目的，并在研究过程中探讨、建立一套系统的制备方法。2．观察并证明所制备的全肾脏脱细胞基质具有规则的三维空间结构，良好的孔隙率，且已将细胞完全洗脱。由于已将在移植中产生抗原性的最重要成分——细胞洗脱，余下的脱细胞基质不存在MHC抗原。后者所诱发的免疫反应为类Th-2反应，与异种移植诱发的典型Th一1反应不同。而这种反应对植入的脱细胞基质并无排斥作用，表明了脱细胞基质具有种属差异性小、生物相容性佳等优点。经本研究建立的方法II硕士学位论文所制备的脱细胞基质，在肉眼观察下呈均一白色

6、半透明，我们通过HE染色光镜观察、扫描电镜观察及细胞核特异性结合染色荧光显微镜观察等方法检测，从而说明其具有良好的微观孔隙结构以利于细胞生长，且已将细胞完全洗脱。3．将制备全肾脏脱细胞基质的方法推广至家兔并作微观观察。在成功制备大鼠全肾脏脱细胞基质的基础上将方法推广至家兔，并作相应的微观观察，说明建立的制备方法简便、可靠，具有系统性，有望推广至猪甚至人类等更大的哺乳类动物。研究方法1．大鼠全肾脏脱细胞基质的制备。取12周龄的Whistar大鼠共20只，10％水合氯醛腹腔注射麻醉下完整切除两侧肾脏，分别保留输尿管、肾静脉及肾动脉。每对肾脏随机取1只作对照组，另1只作实验组。

7、所有肾脏均沿肾动脉插入留置针建立灌注通道。实验组以肝素化PBS溶液轻推测试通道密闭性完整后，依次灌注肝素化PBS溶液，1％十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，去离子水，l％TritonX。100溶液以及含青链霉素的PBS溶液。调整灌注压强及灌注时间，经修正获得最佳方案。。2．大鼠全肾脏脱细胞基质的微观观察。按最佳方案脱细胞处理后，取其中12对标本随机分配3组，每组4对，分别采用HE染色法光镜(I组)观察、扫描电镜(II组)观察支架微观结构，DAPI染色法荧光显微镜(III组)观察残留细胞核成分。I组经10％甲醛灌注固定，脱水、透明、