重组假丝酵母脂肪酶高密度发酵工艺放大及酶热稳定性研究

《重组假丝酵母脂肪酶高密度发酵工艺放大及酶热稳定性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、摘要褶皱假丝酵母脂肪酶(国”幽妇，．“妒s口lipaSe)基因工程菌的高密度发酵研究经历了从5L到800L规模的逐级放大过程，研究显示在小规模(30L以下)发酵条件下，维持pH条件稳定的指数流加控制方式即已能满足高密度生产需求。随着规模扩大，诸多在小规模发酵时可忽略的因素，如环境稳定、产物蛋白降解等，成为了新限制条件，对这些条件进行的单因子和正交优化研究表明，需要采用分段流加控制策略才能够保证大规模发酵成功。该策略将发酵过程划分为两个独立阶段，分别保持pH、温度、搅拌等环境条件的稳定，在48llr时采用近稳态方式进

2、行平稳过渡。实验证明，该策略有利于维持菌体生长和产物代谢平衡。800L发酵实验获得了稳定的14000IUmlJ脂肪酶酶活和约500gr1细胞湿菌重。该发酵工艺高效、廉价，具有大规模工业应用的潜力。耐热脂肪酶研究结果显示氨基酸残基组成、寡肽片段组成和二元模式组成与蛋白耐热性存在显著关联。Al屯His，Le呜Gly，Pro，Phe，Met，1印，Tyr，KC，EE，KE，I也，VE，Ⅵ，EK，VK，EVYV，EYKYVYYY组成与耐热性正相关；ASn，心，Cys，Ile，Gln，Glu，Lys，T虹Ser，QC，QH，

3、QN，HQ，MQ，NQ，QQ，TQ，QS，QT组成与耐热性负相关。三种组成从不同层次，不同角度提取耐热蛋白序列信息，相互关联补充，较为全面的体现了序列性质特征。采用sVM算法的嗜热蛋白分类研究结果显示，同时采用三肽片段特征与二元模式特征的平均分类准确率达到98％，采用三肽片段特征的平均分类准确率达到96％，采用二元模式特征的平均分类准确率达到95％，采用二肽片段特征的平均分类准确率达到85％，而采用氨基酸残基组成特征的平均分类准确率达到74％。在参考DNA重排．(DNAShuming)实验方法的基础上，发展了蛋白质

4、序列重排(SequenceShuming)技术，构建了耐热脂肪酶电子重组体库。该文库包含有15620条由5条嗜热和常温脂肪酶序列经重排算法衍生获得的重组体。经过脂肪酶三元催化特征筛选和耐热性分类筛选，共获得了87条推测耐热脂肪酶序列。接要结构分析结果显示部分推测序列与天然耐热脂肪酶序列高度福似，具有成为新耐热精肪酶的霹施。利用该结果可以减少实验工{乍量，提高成功率。在蛋自质性质改造应用中具有广阔前景。关键词：高密度发酵；发酵放大；脂肪酶；毕赤酵母；蛋白质热稳定性；支持向量机llAb盘fa￡lAbs耄r簌ct弧ehi

5、g瓤eell—d鼹s晦凳溉e壤躐i强◇f国嬲胁璎觯锻li翌Se诬她e潍s≤鹾iw夕括矗纭p鲫柳鼢expressionsystemwasscalcdupfbm5t0800liIlseriesbyoptimizingthefe鼬e撇t主one嘲撼洲越bo也姚辩如勰dpil躐s蹦e．弧e唧。懿enl潍融接ngcombinedwimpH—stats仃ategysucceededinsmallscalesnldies，Whilea“^，o-stagefe豫跫嫩ation鼬fategy'whiehs量li船dat48hrby基

6、嚣e抛正ng熄e戚tufe{emp科a抛reandpH，wasasSessede饿ctive试pilot-scalefe釉entation．Tllliss仃ategylllade雒excellentbalancebe“增entheexprcssionofta唱就p∞teinandmehostcellgrowth觚dg∞atlyimpfoV酣t董狞lipaseyield．AstablelipaseactiVi锣ofappfoximatclyl4，ooOIUm一粕dacenWctweightofca．500gl。1at

7、the800．1i仃escale谳鹏obtained．In丽正tio娃稔懿s，羚s落舔alSoindie越ed畦l蕺啦ec攒塔住ntenvi∞懿me贰si镪atio毂swereessentialformepilot—scalefe姗entation．Thee黼cientalldconVeIlienttechniquesSllgge嫩di程越s娥母e黻&ili溆触也erS鼹le一岭奴i曩如鲥鑫llipaSe蹬砖黼tio建．Thedif匏rencebetweenm咖lop拭licproteillprima拶sequen

8、ceandmesophilic肚inp彝ma搿seqlleneew弱stl撕iedtod主seoVef氇em移ch雒i滩ofp∞tein壤锄osta_b主li职11le聪latioIlshipbe“Ⅳeenresiduescomposition撇doligo—pe硼de(di-／lri-peptide)typew舔躐纛lyz甜。Me糕蜥le，氇edis纽t碰