非洲猪瘟病毒p30重组蛋白的表达与单克隆抗体制备

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1、储德文：非洲猪瘟病毒p30重组蛋白的表达及单克隆抗体制备技术是用于监测和控制非洲猪瘟暴发流行的有效方法。其中，病毒核酸检测和ELISA操作简单，可以快速敏感的检测ASF，是监测ASF传播流行首选的两种方法。1．4．1血细胞吸附试验此方法由Malmquist等‘151提出，猪的红细胞能附着在感染了ASFV单核细胞或巨噬细胞表面，即血细胞吸附试验。古典猪瘟病毒(CSFV)没有这种特性，后续发现表明某些CSFV也有血细胞吸附现象，这增加了ASF鉴别的难度。1．4．2易感动物接种试验临床上很难区别猪瘟(CSF)和ASF，可用动物接种实验

2、加以区分。将病料接种猪瘟易感猪和猪瘟免疫猪，若二者都发病，则可确定为ASF；若易感染猪发病而免疫猪不发病则为猪瘟；若二者都不发病，则为其他病。若以此试验不能判定，可用敏感猪再做一次。此法为OIE推荐的标准试验之一(16】，其特点是灵敏度高，操作要求低，一般试验室都可进行。1．4．3荧光抗体试验1963．1964年在西班牙发现了无血细胞吸附现象的ASFV，因此红细胞吸附试验无法检测出该病毒，对此可用荧光抗体试验(FⅪ)，该试验还可与伪狂犬病加以区分。此法的优点是经济、快速、敏感，操作要求高，还需高质量的荧光标记抗体和荧光显微镜，且

3、对亚急性和慢性型ASF检测敏感性仅为40％，所以只能辅助检测ASF。1．4．4病毒核酸试验McKillen等‘171建立了实时荧光定量PCR分子(molecularbeacon)技术，此法可快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和ASFV，此法对血清、组织中的病毒等临床样品具特异性，比普通PCR更敏感；Zsak等建立的TaqMan探针荧光实时定量PCR技术只需2h就可完成整个反应【18】。在猪表现出临床症状前就可检测到期扁桃体中的ASFV，因此该法可诊断和监测ASF，还可作为疾病暴发时的

4、应急检测措施；郭少平等建立了基于ASFVK205R基因的实时荧光定量PCR检测方法【19】，此法比基于P72基因的检测方法特异性强且更具敏感性，可用于非洲猪瘟的快速检测和监测；Gonzague等建立了采用阳性内参法检测临床样品中的ASFV的PCR方法，通过用同一对引物扩增内控片段和目的DNA来区分它们的大小，此法优点在于防止假阴性结果出现。PCR检测方法特异性和敏感性都很高，结果可靠。曾少灵等根据ASFV的VP73序列设计了一对特异性引物，扩增出大小为251bp的片段，比OIE推荐的两种引物灵敏度高出扬州大学硕士学位论文100多

5、倍，但特异性相卦20】；Bastos等扩增出P72基因的c2端478bp片段，用进化树分析核酸序列分析了不同疫区来源的ASFV，证实P72基因高度保守且同源性高【2l】，此法可用于ASF的分子流行病学调查。除了以上介绍的两种PCR方法以外，多重PCR、巢氏PCR和环介导恒等温核酸扩增技术也用于ASF的检测。总之，PCR法检测快捷、高效，但费用较高，且对工作人员操作要求很高。1．4．5酶联免疫吸附试验因没有疫苗抗体干扰，所以检测ASFV抗体具重要意义，尤其是亚急性和慢性型病例，患病动物组织液和血清均可用来检测，OIE将ELISA作

6、为血清学检测ASFV的首选方法，目前应用最广的是间接ELISA和夹心ELISA。Wardley等‘221于1979年建立此方法，敏感性和特异性较高。随后，Pastor等利用ASFV主要结构蛋白p73与在含有猪血清培养液中生长的感染细胞的高特异胞浆可溶性片段(CS．P)建立了检测ASFV的两种ELISA方法。这两种抗原在对流免疫电泳试验(IEOP)与ELISA表现出一致的特异性。敏感性试验表明，CS．P抗原比P73抗原至少能提前2d检测出ASFV抗体；蒋正军等‘231用重组杆状病毒在sf9细胞中表达了72kD的重组蛋白p72，包被

7、后用标准阳性血清验证了该重组蛋白的生物活性。其对该间接ELISA条件进行优化后，采用509L的微量法，节约了试剂，缩短了时间，为快速诊断ASF提供了可能。阻断试验和交叉试验表明ELISA法有良好的特异性，间接ELISA相比于Dot．ELISA法，更具灵敏性，这些为非洲猪瘟ELISA快速检测试剂盒作了实验准备；P6rez．Filgueira等㈣利用重组杆状病毒表达了ASFVP30蛋白，并以此重组蛋白为抗原建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法，与OIE介绍的方法进行比较发现，用来自西班牙ASFV毒株P30重组蛋白为抗原建立的E

8、LISA方法检测不同地区血清样品(672份)时，西部非洲血清样品完全符合，而东部非洲样品不符合，说明由于分离株具有地域性，可影响其检测结果。1997年，Vidal等【251建立了用单克隆抗体检测非洲猪瘟p73蛋白的夹心ELISA诊断方法。用此方法检测p73抗原的