非洲猪瘟病毒vp73蛋白的原核表达纯化及单克隆抗体的制备与鉴定

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1、分类号S852学校代码10129UDC57.083.3学号2009201047非洲猪瘟病毒VP73蛋白的原核表达纯化及单克隆抗体的制备与鉴定ProkaryoticExpressionandPurificationofProteinVP73inAfricanSwineFeverVirus,andPreparationandIdentificationofMonoclonalAntibodies申请人：陈轶学科门类：农学学科专业：基础兽医学研究方向：兽医药理学与毒理学指导教师：曹金山教授吴晓东副研究员论文提交日期：二〇一二年五月摘要非洲猪瘟（Africanswinef

2、ever，ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（Africanswinefevervirus，ASFV）感染猪引起的急性、热性、烈性、高度接触性传染病，二十世纪中期以来，已在非洲、欧洲和美洲等数十个国家流行，并在近几年内蔓延至欧亚接壤的格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆以及俄罗斯境内，一旦侵入我国，危害极大。VP73蛋白是ASFV的主要结构蛋白，由B646L基因编码，分子量约为73ku。VP73是病毒粒子二十面体衣壳的重要组成部分，产生于病毒感染的晚期，约占整个病毒粒子蛋白的32%。VP73蛋白作用主要体现在非洲猪瘟病毒结合进入受体细胞过程中和病毒粒子衣壳的产生两方面。大多数非

3、洲猪瘟病毒毒株都有很强的毒力以及相反地很低的免疫原性。有研究表明，各地区的毒株产生的VP73抗体相应抗原表位都很保守，VP73蛋白具有稳定的抗原性，是血清学检测和免疫制剂常用蛋白。VP73参与了病毒的吸附过程，针对VP73的抗体可以阻断病毒与巨噬细胞的结合。此外VP73还参与了病毒装配过程中pp220和pp62的加工。基于此背景，本论文根据已发表的非洲猪瘟病毒VP73基因核酸序列的主要抗原表位区，自行设计一对引物，以阳性质粒pMD18T-VP73为PCR扩增模板，进行PCR扩增，获得了612bp大小的核酸片段，将其克隆入原核表达载体pET32a(+)，构建原核表达

4、载体pET32a-vp73。鉴定正确的原核表达载体转化至宿主菌E.coliBL21（DE3），挑取阳性克隆菌落培养，IPTG诱导后裂解菌体作12%SDS-PAGE蛋白电泳分析，出现大小约43ku的融合蛋白条带。融合蛋白纯化后经Westernblot分析，表明该蛋白具有较好的免疫原性。通过摸索表达条件，优化了重组VP73蛋白的表达：用含100mM氨苄的LB液体培养基37℃振摇培养，待菌生长至0D值为0.6时，用终浓度为0.8mM的IPTG诱导，于37℃振荡培养5h。对离心收集后的菌体上清和沉淀进行SDS-PAGE分析表明，融合蛋白以包涵体的形式存在，经超声波裂解菌体

5、后，分离包涵体并离心、洗涤，再用6M尿素溶解包涵体，最后用试剂盒纯化融合蛋白。以原核表达并纯化的非洲猪瘟病毒VP73蛋白为免疫原，按常规方法免疫BALB/c小鼠，细胞融合前建立了间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株的最佳反应条件。即：抗原包被浓度为2μg/mL，以1:1000稀释的阴、阳性血清分别作为阴、阳性对照，反应条件均为37℃1h。取免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，对杂交瘤细胞进行筛选，阳性孔经三次有限稀释法克隆，最终获得一株持续且稳定分泌抗VP73蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为1C8。对该株杂交瘤细胞株的稳定性、亚类、腹水效价、特异性

6、和生物学活性进行了鉴定。结果表明，所获得的单克隆抗体稳定性好；经亚类鉴定，该株杂交瘤细胞分泌的抗5体类型为lgGI亚类；其腹水效价达到1.024×10以上；该株单抗特异性针对目的蛋白而非针对组氨酸标签蛋白，且与其他病毒的蛋白无交叉反应，特异性较好。关键词：非洲猪瘟病毒；VP73蛋白；原核表达；单克隆抗体；ProkaryoticExpressionandPurificationofProteinVP73inAfricanSwineFeverVirus,andPreparationandIdentificationofMonoclonalAntibodiesAbstr

7、actAfricanswinefever(ASF)isahighlycontagiousandfatalhemorrhagicviraldiseaseofdomesticpigs,andcausedbyAfricanswinefevervirus(ASFV).Sincethemid-twentiethcentury,ASFhasbeendisseminatedindozensofcountriesinAfrica,EuropeandAmerica,andinrecentyearsitspreadtoGeorgia,Armenia,AzerbaijanandRuss

8、ia.On