降钙素原的重组、表达与单克隆抗体的制备

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1、硕士学位论文降钙素原的重组、表达及单克隆抗体的制备硕士研究生：陈跃瑜指导老师：李明摘要目的：在严重细菌感染性疾病的诊断中，降钙素原以其潜在的应用价值已成为应用研究热点。降钙素原(pTocalcit0血，PC-T)是无激素活性的降钙素(calcitoniIl’CT)前肽物质，为含116个氨基酸的糖蛋白，半衰期为20一24小时，在体内稳定性好。在正常及健康的个体中，PcT经一系列的酶催化作用最后水解形成cT，故其血清PcT的浓度极低，仅为lO--50pg／ml，一般的方法检测不到。在系统炎症反应综合症(SlRS)、败血症、败血症休克等严重细菌感染患者的血清Pcr显著升高，其浓度

2、可达正常水平的几倍甚至上万倍，并且PCT浓度和疾病严重程度成正相关，并随着病情的发展变化而变化，因而PCT可作为诊断严重细菌感染、判断病情与预后以及疗效观察的可靠指标．本实验根据Oenbank的人源PCT全序列修改了部分稀有密码子，改变部分碱基序列但保持其氨基酸序列不变，采用多引物人工一步合成基因技术合成降钙素原的全长基因，并将其构建于原核表达载体pGEx_4-1中，得到重组表达载体pGEX--4T-1／PCT，将pGEX-4，r-1／PCT转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达，得到融合蛋白经纯化后进行动物免疫，用改良了的方法进行细胞融合后，采用细胞筛选方法以获得可稳定分泌鼠

3、抗人PCT蛋白的杂交瘤细胞株，为日后制备抗PCT单克隆抗体，制备检测PCT试剂盒，及研究PCT的来源、生理病理功能等提供了良好的实验基础。．方法：根据Genbank的人源PcT全序列修改了部分稀有密码子，改变部分碱基序列但保持其氨基酸序列不变，使目的基因能更好地在大肠杆菌中高效表达。利用引物设计软件，根据所设计的PCI"的全长基因设计了18条引物，并在第一和第十八条引物分别引入BamHI和XhoI两个酶切位点，采用多引物人工一步中文摘要合成基因技术将18条引物一次合成PCT的全长基因，以合成的全长基因为模板进行PCR扩增后构建于pMDl8．T载体中，将pMDl8-1伊CT转

4、化TOPl0后提取质粒经酶切鉴定并将菌液送测序。测序正确后将pMDl8-T／PCT重组质粒进行BamHI和XhoI双酶切并割胶回收目的基因，再构建于原核表达载体pGE妊4r-1中，得到重组表达载体pGEx-4TLl／PCT，将pGEX．41．．1／PCT转化大肠杆菌BL21，通过IPTG诱导表达，得到了融合蛋白，与所购买的抗PCT单克隆抗体进行Westernblot鉴定。融合蛋白经谷胱甘肽一S一转移酶亲和层析柱纯化，免疫Balb／c小鼠。用改良了的方法进行细胞融合后，采用细胞筛选方法得到2株可稳定分泌鼠抗人PCT蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为6A4、71)6．并将由杂交瘤细

5、胞株所分泌的鼠抗人PCT蛋白与已纯化的PCT蛋白进行Westernblot检测其特异性。结果：采用多引物人工一步合成基因技术合成PCT的全长基因，PCR扩增后构建于pMDl8-T载体中，将pMDl8-T／PCT转化TOPl0后提取质粒经BamHI和XhoI双酶切鉴定，得到了大小与预期相符的目的条带。将经酶切鉴定J下确的菌株送测序，将测定的基因序列与所设计的PcT序列用0miga分析软件进行同源性分析。结果显示有一株菌株目的基因序列与所设计的PCT序列100％相符，表明重组载体中插入的序列为PL'T的全长基因，插入序列中无碱基突变。将测序正确的pMDl8-T口CT重组质粒进行

6、BamHI和XhoI双酶切并割胶回收目的基因，再构建于原核表达载体pGEx．4，r-1中，得到重组表达载体pGEX-_4TLl／PCT，将pGE)m1／PCT转化大肠杆菌B121，提取质粒进行BamHI和XhoI双酶切鉴定，锝到了大小与预期相符的目的条带。通过IPTG诱导表达，得到的融合蛋白经15％SDS．PAGE电泳鉴定在相当分子量为40kll处有目的蛋白出现，与预期相符。将融合蛋白与所购买的抗PeT单克隆抗体进行Westernblot鉴定结果显示融合蛋白与抗PeT单克隆抗体可发生特异性反应。融合蛋白经谷胱甘肽一S一转移酶亲和层析柱纯化，得到了纯度>60％的GST-PCT

7、蛋白。成功免疫Baib／c小鼠，得到血清效价1：20000的小鼠，采用经改良的方法进行细胞融合后，筛选得到2株可稳定分泌鼠抗入PeT蛋白的杂交Ⅱ硕士擘位论文瘤细胞株，分别命名为6A4、7D6。经Westernblot鉴定由杂交瘤细胞株所分泌的鼠抗人PCT蛋白与已纯化的PCT抗原可发生特异性反应，与菌体蛋白不反应，特异性较强。结论：1．根据Genbank的人源PCT全序列修改了部分稀有密码子但保持其氨基酸序列不变，使目的基因能在大肠杆菌中高效表达。2．改变传统的直接从基因库中提取目基因的方法，而改为采用多引物人工一步