三氧化二砷诱导白血病细胞株自噬性死亡及其分子机制的研究

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1、声竹歹，．六：妒坝t学位论文三氧化二砷诱导白血病细胞株自噬性死亡及其分子机制研究浙江大学医学院内科学(血液病)2003级硕士研究生刘俊青导师钱文斌主任医师摘要国内外临床研究已经证实三氧化二砷(Arsenictrioxide，As2C．，)可有效地治疗复发和／或初发的急性早幼粒细胞白血病(AcutePromyelocyticLeukemia，APL)，并能达到完全缓解。由于As203和化疗药物作用的靶点不同，临床应用时亦没有明显的骨髓抑制；且没有化疗药物的其他严重毒副反应。因此，国内外研究人员试图将As203应用于其他恶性肿瘤的治疗。在血液肿瘤方面，许多体外实验研究表明：As203

2、可诱导髓系、淋巴系和浆细胞等恶性血液病细胞株凋亡。在临床研究方面，As203已经进入治疗慢性粒细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征(MDS)等疾病的临床I期和II期研究。但是As203治疗淋巴细胞白血病的研究报道尚少，其对淋巴细胞恶性肿瘤和MDS的作用机制尚不清楚。本研究采用MTT(3一(4，5一dimethylthiazol一2一y1)一2，5-diphenyltelra—zoliumbromide)比色法观察As203对T细胞白血病细胞株Molt．4和MDS细胞株Mutz．1细胞的生长抑制作用。结果发现，As203可显著抑制两种白血病细胞株的生长

3、，并呈时间一剂量依赖性。药物作用48小时对Molt．4细胞的半数抑制浓度(IC50)为4．689mol／L，对Mutz．1细胞的IC50为1．79p．mol／L。用碘化丙啶(PI)和AnnexinV对As203处理的白血病细胞株双标记，流式细胞仪(FACS)检测结果显示AnnexinV+、PI一细胞(即凋亡细胞)呈剂量依赖性增加，提示As203导致了白血病细胞凋亡。同时，FACS分析结合TUNEL检测法表明：As203诱导的死亡细胞一部分是TUNEL阴性的。荧光显微镜下观察细胞在细胞膜没有破坏的情况下PI能否染色细胞，结果显示：药物处理48h后，细胞被PI所标记，提示药物处声衍夕

4、，·六掌硕L学位论文理能够导致白血病细胞发生非凋亡形式的死亡。Western-Blot分析结果显示：药物作用Molt-4细胞后，启动Caspase蛋白，即Caspase．8和Caspase-9被激活，呈时间依赖性：Bid也被激活，提示Caspase．9可能通过Bid的激活而被激活。执行Caspase蛋白中，Caspase．7呈时间依赖性激活，而Caspase．3、Caspase一6没有显著变化。Caspase抑制剂实验结果显示：Pan-caspase抑制剂能部分抑制As203诱导的Molt-4细胞凋亡，而Caspase-3、Caspase-7和Caspase-8抑制剂均不能抑制A

5、s203诱导的Molt-4细胞死亡。应用透射电镜观察药物作用前后白血病细胞的超微结构。实验结果显示，药物作用后，白血病细胞的细胞膜不完整，胞浆中出现大量囊泡。提示As203诱导的Molt-4和Mutz-1细胞发生了自噬性细胞死亡，有别于细胞凋亡。磷脂酰肌醇激酶3(Phosphatidylinositol3-kinase，P13}㈨KT)远路的抑制剂(3．MA)预育后再和As：03共同作用于白血病细胞株(4“MAs203作用于Molt-4细胞48h，2laMAs203作用于Mutz-1细胞48h)，流式细胞仪(PI和FSC参数)分析3-MA对As203诱导的非凋’L二细胞的抑制作用

6、，结果表明3-MA显著抑制了非凋亡细胞的产生，同时3-MA显著增加了细胞凋亡。用Western．blot分析结果显示用三氧化二砷作用后的Molt-4细胞磷酸化的AKT上调，而用3-MA作用后的磷酸化的AKT下调，进一步证明As203诱导了白血病细胞发生自噬性死亡。近年来研究发现，自噬性细胞死亡作为非细胞凋亡死亡的一种主要方式在恶性肿瘤的发生和发展中起着十分重要的作用。但目前对血液肿瘤的自噬性细胞死亡及其机制尚不清楚。Jia等报道肿瘤坏死因子a诱导T淋巴细胞白血病细胞株发生凋亡前有自体吞噬现象发生。动物实验研究表明，Beclin一1～人类Bel-2相互作用蛋白基因敲除的小鼠容易发生

7、上皮细胞和血液系统恶伊肿瘤。Saeki等报道应用Beelin-I反义寡核苷酸处理HL-60细胞导致了自噬性细胞死亡。2003年Kanzawa等的研究表明As203可诱导神经胶质瘤肿瘤细胞发生自噬性细胞死亡，但作用机制还不清楚。这些研究和我们的实验结果均提示自体吞噬和自噬性细胞死亡在血液肿瘤的发生、发展中起重要作用，对血液肿瘤细胞的自噬性死亡及其信号途径研究将有可能为血液肿瘤的治疗提供新的靶点。．主持歹，z掌聩}学位论文我们应用Western-blot和定量实时RT-PCR研究了A