rnai技术干扰survivin基因对喉癌hep-2细胞作用的实验研究

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1、郑州人学2007年博十研究生论文中文摘要RNAi技术干扰Survivin基因对喉癌Hep一2细胞作用的实验研究博士研究生刘善廷导师娄卫华郑州大学一附院耳鼻咽喉．头颈外科郑州450052摘要喉癌是耳鼻咽喉科常见恶性肿瘤，发病率高，在我国约占全身肿瘤的1—2％，占耳鼻咽喉恶性肿瘤的11—22％。早期喉癌治疗以手术或放疗为主，中晚期喉癌多采用以手术为主的综合治疗，尽管20世纪80年代以来，喉癌的治疗取得了较大的进展，手术、放疗、化疗和免疫治疗的联合应用，大大提高了患者的5年生存率和生活治疗。但手术、放疗和化疗致残率高、并发症多、毒副作用大

2、，手术后复发和转移仍是喉癌患者的主要致死原因，5年生存率的进一步提高似乎进入瓶颈，难以有突破性进展。因此寻找新的有效、简便、毒副作用小的治疗方法成为耳鼻咽喉科工作者关注的焦点，尤其是肿瘤形成早期和治疗后肿瘤负荷小的情况下，对亚临床病灶的恰当处理，是避免恶性肿瘤复发、转移，和提高5年生存率的关键。对于手术或放疗后的亚临床病灶的处理，是影响恶性肿瘤预后的关键步骤，也是人们近年来研究的热点。肿瘤生物治疗(Biotheropy)是应用现代生物技术及其产品进行肿瘤防治的新疗法，它通过调动宿主的天然防卫机制或给予天然(或基因工程)产生的针对性靶

3、向性很强的物质来取得抗肿瘤的效应。随着对肿瘤发生发展分子机制的深入研究和生物技术的发展，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗中的第四种模式。恶性肿瘤的生物治疗主要有：基因治疗，肿瘤疫苗治疗，生物反应调节剂治疗等。其中基因治疗不仅能够使恶性肿瘤细胞的恶性表型逆转，抑制肿瘤生长，而且可以使受到损伤的细胞得以修复，去除引起突变的始动因素，是一种直接有效的治疗。这种治疗应用于临床，已经取得可喜的成果。但‘，‘!>￡；{郑州大学2007年博l：研究生论文中文摘要传统肿瘤基因治疗的转染效率低、靶向性差、抗癌基因表达量低的缺点。为解决以上缺点，近年来RN

4、Ai干扰技术被应用于恶性肿瘤基因治疗的试验研究。其原理是小片段RNA(siRNA)利用碱基互补的原理，特异性地结合癌基因的mRNA，干扰其翻译、转录形成蛋白质的功能，阻抑癌蛋白的生成。使癌细胞向成熟方向分化或诱导细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。RNAi技术是在核酸水平改变肿瘤操控基因的治疗方法，特异性强届4作用小，有希望成为新的基因治疗途径。Survivin是新近发现的tAP家族成员之一，是目前发现的抗凋亡能力最强的凋亡抑制因子，具有不同于IAP家族其他成员的独特性质和结构，在正常成人组织中不表达而选择性地表达于恶性肿瘤组

5、织，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关，这种独特的表达特性及其与恶性肿瘤发生、发展的密切关系，使其成为恶性肿瘤诊断与治疗的新靶点。基于以下目的：1．探讨survivin基因在喉癌组织中的表达及其与喉癌发生、发展和转移的关系；2．观察利用RNAi技术敲除喉癌细胞中survivin基因对喉癌细胞凋亡的影响，3．RNAi技术作用于活体喉癌细胞的效果；4．RNAi技术应用于活体的安全性。本研究用免疫组织化学方法检测喉鳞癌标本中survivin及其它凋亡相关基因的表达及其和喉癌l

6、缶床特点的关系，探讨它们在喉癌的发生、发展中的作用。建立

7、以survivin基因为目的基因，质粒为载体的siRNA，脂质体包埋，转染喉癌Hep．2细胞，观察转染后细胞的生长情况、survivin的表达和细胞凋亡。建立Hep．2细胞裸鼠模型，静脉途径给药，观察瘤体增长情况，瘤细胞内survivin的表达和细胞凋亡。方法1．采用免疫组化检测人喉鳞癌细胞中survivin，caspase--3，bcl--2，bax，p53基因的表达。2．采用细胞免疫化学法观察survivin蛋白在喉癌Hep．2细胞系中的表达情况。3．脂质体包埋survivinRNA，转染喉癌hep一2细胞。采用western．

8、blotting方法检测survivinsiRNA转染后对喉癌Hep．2细胞中survivin蛋白水平的影响。4．采用RT-PCR方法检测不同浓度、不同作用时问survivinsiRNA对survivin郑州大学2007年博+研究生论文中文摘要mRNA表达的影响。5．采用甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT)检测survivinsiRNA转染前后对喉癌Hep．2细胞增殖的影响。6．紫杉醇、紫杉醇+siRNA转染组作用喉癌Hep．2细胞，应用流式细胞仪对对照组和处理组进行细胞周期和凋亡分析。7．建立裸鼠种植瘤模型。于裸鼠前腿背侧注入Hep-2

9、细胞(2x107／ml，0．2ml／只)，成瘤后随机分为A、B、C三组，分别给予PBS2001al，紫杉醇200p1，紫杉醇+siRNA200m腹腔注射。8．免疫组织化学检测裸鼠种植瘤PBS组、紫杉醇组、紫杉醇+siRNA组survi