eb病毒致瘤蛋白lmp1调节p53功能活性的研究

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1、摘要鼻咽癌是中国南方高发的肿瘤，具有人种和人群的易感性、家族聚集现象、低分化和高转移为主的临床病理特征，并与EB病毒高度相关。其中EB病毒编码的潜伏膜蛋白LMPl是重要的致瘤蛋白，以鼻咽癌为切入点，我们多年的研究工作一直致力于LMPl介导的信号转导通路的研究。从建立LMPl可调控表达体系入手，以细胞内重要的信号转导分子NF-r．_B、AP．1、STAr作为枢纽，系统地研究了LMPl介导的信号转导通路异常以及由此产生的一系列生物学效应。p53是重要的抑瘤基因，作为细胞基因组稳定性的“守护神”(guardian)，p53蛋白对细胞的存活具有双面性(doublefaces)：p53通过作用于

2、受损细胞的细胞周期限制点，延缓细胞周期行进，以使细胞在DNA复制和细胞分裂前修复DNA损伤保证细胞高质量存活；但当DNA损伤超过细胞的修复能力时，则促使细胞进入凋亡。在50％以上的人类肿瘤中存在有p53的突变，p53功能的丧失是人类肿瘤发生发展过程中常见的分子事件。与其他肿瘤细胞不同的是，在鼻咽癌qbp53基因的突变频率很低(<10％)，且出现]'p53蛋白积聚的现象。临床样本的检测发现p53的过表达与鼻咽癌的发病密切相关，p531拘表达在鼻咽癌组织和癌旁组织中显著的相关性提示p53的过表达出现在鼻咽癌癌变的早期发展阶段，且随着鼻咽癌病程的发展，p53的阳性表达率及表达强度均增加，与淋

3、巴结的转移也具有一定的相关性。在构建的LMPl转基因小鼠中也发现p53的积聚现象。这些结果强烈提示我们：p53在鼻咽癌发生和发展过程中可能具有功能活性。我们前期的研究工作发现病毒致瘤蛋白LMPl通过调节p53表达的增加，导致细胞G2／M期行进过程中重要的正性调节因子cdc2／eyclinB1复合物激酶活性下降，使其停滞于G2／M期。这提示我，f1"]p53作为一个受EB病毒LMPl调控的关键转录因子在细胞周期调节中具有重要的功能。除此之外，已有研究表I明LMPl通过p53上调抗凋亡基因A20，Bcl．2，Survivin和△NP63抑制凋亡的发生。故LMPl介导p53增加而不诱导肿瘤细

4、胞发生凋亡。研究发现，LMPl通过调节p53从而稳定EB病毒的潜伏感染，促进上皮细胞的转化，有助于宿主和病毒之间平衡的维持。这为我们从一个新的视野来研究和理解p53在EB病毒感染中的病理生理学意义提供了新的启示。一直以来，关于EB病毒转化作用的研究都是在非鼻咽上皮来源和非上皮细胞来源的细胞中进行的，EB病毒感染和其编码的致瘤蛋白LMPl所参与的信号转导通路的研究局限于肿瘤细胞中完成，不能充分阐明癌变多阶段演进过程中的分子机理以及遗传因素和环境因素在癌变过程中的相互作用关系。在国家自然科学基金委与香港研究资助局联合科研资助基金(No．30418004)的资助下，我们引进了体外处于癌变早期

5、阶段的实验模型平台：NP69、转染了空白载体pLNsx的NI，69巾LNSX和转染TLMPl的NP69-LMPl细胞模型。因此，利用永生化的鼻咽上皮NP69细胞模型探讨肿瘤的发病机理是一个很好的切入点。我们首先对NP69细胞模型中p53的特征进行了研究，在该模型中证实有大量游离的、野生型的p53的存在，．H．LMPl不仅能促进p53的核积聚，同时还促进p53的转录活性和蛋白水平的表达。这为我们进一步利用该细胞模型研究致瘤蛋白LMPl调节p53功能活化的分子机制提供了重要的基础。Ⅱp53翻译后修饰是其最主要的激活机制，其中一个重要的机制是磷酸化。近年来p53磷酸化对p53的功能活化取得了

6、新的进展。已有将近18个p53的磷酸化位点得到阐明，它们分别位于p53功能结构域的N端、核心区和C末端，其中以N末端和C末端较为集中，不同的磷酸化位点参与p53转录活性、稳定性和抗凋亡功能的调节。但病毒致瘤蛋白LMPl对p53磷酸化的调节尚不清楚。从众多的p53磷酸化位点中，我们选取了N末端具有代表性的p53Serl5、Ser20和Thr81，以及C末端的Ser392作为研究对象，来阐明p53的功能活性。蛋白的磷酸化需要一种或多种蛋白激酶的作用。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路是由一组级联活化的丝／苏氨酸蛋白激酶组成，主要包括，ERKl／2、JNK和p38激酶通路，MAPK对于细

7、胞周期的运行和基因表达具有重要调控作用。已有研究表明在UV或DNA损伤等外界环境因素的刺激下，MAPK通路的活化能{吏p53多位点磷酸化。新近研究证实MAPK信号级联通路在LMPI介导的肿瘤发生发展中起着非常重要的作用。因此从翻译后修饰一磷酸化的水平来研究在LMPl的作用下p53激活的分子机翻将为我们深入了解LMPl致瘤的病理生理功能提供重要的启示。利用NP69细胞模型为材料，通过本研究发现，LMPl能显著促进p53Ser15、Ser20、Se