弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hxgprt）和腺苷激酶（ak）基因克隆、表达及多抗血清制备

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1、安徽医科人学硕I：论立=英文简写AKAPSbpcDNADABELISAHRPHXGPRTSDS．PAGEKanaEDTAMcAb0PD0RF中英文缩略词对照表英文全称adenosinekinaseAmmoniumPersulfatebasepaircomplementaryDNAdiaminobenzidineenzymelinkedimmunosorbentassayhorseradishperoxidasehypoxanthine-xamhine-guaninephosphoribosyltra

2、nsferaseisopropylthio-p——D—galactosidekilobasekilo-daltonluria-Bertanimediummolecularwei．ghtnitrocellulosememberane5-bromo··4-chloro··3一indolyl·beta·-D—galactopyranosidesodiumdodecylsulphatepolyacrylamidegelelectrophoresisKanamyeinEthylenediaminetetraa

3、ceticacidmonoclonalantibodyo-phenyldiaminoopenreadingframe中文全称腺苷激酶过硫酸胺碱基对DNA互补DNA二氨基联苯胺酶联免疫吸附试验辣根过氧化物酶次黄嘌呤．黄嘌呤．鸟嘌吟磷酸核塘转移酶异丙黜．P．I)-半，魄苷干碱基对千道尔顿LB培养基分子量硝酸纤维紊膜5一溴4氯?3—9-D吲哚V-％糖苷十二烷基磺酸钠．聚丙烯酰胺电泳卡那霉素乙二胺四乙酸单克隆抗体邻苯二胺丌放阅读框烈鼬渤沾蝴№婚安徽医科人学坝I{Q文PBSPhosphateBufferPCR

4、polymerasechainreactionPEGpolyethyleneglycolTEMEDtetramethylethylenediamine；1,2-did(dimethylarnino)ethane．磷酸盐缓冲液聚合酶链反应聚乙二醇四甲基乙二胺学位论文独创·

5、生声明本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并

6、表示谢意。学位论文作者签名试，5’蔓日期：——学位论文使用授权声明本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名勰导师签名日期：枷。7一f了日期安徽瓯科大学顾{：论文弓形虫次黄嘌呤．黄嘌呤．鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPR

7、T)和腺苷激酶(AK)基因的克隆、表达及多抗血清的制备硕士研究生李霞导师沈继龙教授安徽医科大学病原生物学教研室；安徽医科大学人兽共患病研究所教育部省部共建重要遗传病基因资源利用重点实验室(安徽医科大学)合肥230032中文摘要目的：克隆弓形虫RH株次黄嘌呤．黄嘌呤氆}嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)和腺苷激酶fAK)基因，构建原核表达载体pET28a／HXGPRT和pET28a／AK，表达HXGPRT和AK重组蛋白，利用此重组蛋白免疫新西兰白兔制各多抗血清。方法：复苏本室液氮保种的弓形虫RH株速殖

8、子，腹腔接种BALB／c小鼠。转种3代，抽取腹水，收集、纯化弓形虫株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入BamHI和XhoI酶切位点。应用RT-PCR扩增弓形虫HXGPRT，AK基因片段，目的基因HXGPRT插入克隆载体pMDl8-T，目的基因AK插入克隆载体pGEM—T，提取重组质粒，BamHI和XhoI双酶切获得目的基因，插入原核表达质粒pET28a中，重组子双酶切、PCR和测序鉴定，转化大肠杆菌E．cobBL21(DE3)并以IPTG诱导表达。亲和层析法纯化重组蛋白抗原，SDS-PAG

9、E和Westernblotting验证表达量和免疫活性，改良的Bradford(考马斯亮蓝)法测定纯化rHXGPRT和rAK蛋白浓度。免疫新西兰白，收集多抗血清，ELISA测定多抗滴度，Westernblotting鉴定免疫活性。结果：RT-PCR从弓形虫RH株RNA中扩增出693bp的HXGPRT和1092bp的AK目标基因片段。成功地将其克隆入立徽医科大学硕J：论史pET28a。pET28a／HXGPRT和pET28a／AK经Baml-lI和Xho!双酶切，获得与