次黄嘌呤核苷的提取及鉴定

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1、次黄嘌呤核苷的制备及初步提取制药11301班第2组成员：江呈风陈俊周丽许欣朱赢一·背景介绍定义次黄嘌呤核苷（inosine）也称肌苷。是以次黄嘌呤为碱基部分的核糖核苷的一种。次黄嘌呤核苷为白色结晶性粉末或类白色结晶性粉末，无臭；味微苦；在水中略溶，在氯仿、乙醇中不溶，在稀盐酸或氢氧化钠等碱溶液中易溶。肌肉中含量最多，酵母、尿液中也存在。从腺苷与亚硝酸作用或酶解脱氨后得到。紫外线最大吸收248纳米。在核苷磷酸化酶的作用下主成次黄嘌呤。分子结构分子式：C10H12N4O5分子量：268.23次黄嘌呤核苷次黄嘌呤核苷的作用次黄嘌呤核苷的用途十分广泛，是食品和医药产品的重要中间体。在医药工业领

2、域，肌苷可以直接透过细胞膜进入细胞内参与人体代谢，促进体内能量代谢和蛋白质合成，提高丙酮酸氧化酶活力，使低能、缺氧状态细胞的腺三磷水平提高。在医疗上广泛用于治疗心脏病、肝病及由放射线和抗癌药物所引起的白血球减少症、血小板减少症、视神经萎缩、中心性视网膜炎、并能预防和解除由血防药物引起的对心脏或肝脏的副作用；另外还是作为合成利巴韦林、阿昔洛韦等核苷类抗病毒药物的重要中间体；在食品工业领域，次黄嘌呤核苷是作为呈味核苷酸肌苷酸二钠的主要原料，与鸟苷酸二钠混合简称I+G，添加到味精中即是第二代、第三代味精，具有十分广阔的市场。目前，I+G需求量以每年10％-20％的速度增加。二.制备工艺方法介

3、绍次黄嘌呤核苷的生产方法有化学合成法、菌体自溶法、发酵法。由于化学合成法需要大量有机溶剂，存在原料来源及环境污染等问题在生产中极少使用；菌体自溶法由于其效率太低目前也基本不用；发酵法生产次黄嘌呤核苷由于其产率高、周期短、控制容易等优点，目前已经成为工业化生产次黄嘌呤核苷的重要方法。以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为发酵菌种制备核苷具有产量高、产物中副产物少、便于产物分离提取等优点，因而，枯草芽孢杆菌成为核苷发酵工业最重要的生产菌。制备步骤①选用枯草芽孢菌GDIR-1005为保藏菌种；②将葡萄糖∶磷酸氢二钾∶硫酸镁∶苹果酸钠∶酵母粉∶琼脂∶水按1％∶0.2％∶0.1％∶

4、0.2％∶2％∶∶2％∶94.5％的重量百分比，配制成初级菌种培养基并装入茄瓶；③将步骤②中的初级培养基接入保藏菌种，接种量为0.1％，在温度37±0.5℃条件下静置培养20h±2h后获得初级种；④将步骤③得到的初级菌种，放入按葡萄糖∶磷酸氢二钾∶硫酸镁∶苹果酸钠∶酵母粉∶水＝3％％∶0.2％％∶0.1％％∶0.2％％∶1.5％％∶95％％重量百分比配制成的摇瓶培养基中，并在往复式摇床上培养，160±10转/分，温度37℃±0.5℃，时间周期10～12h，当菌种镜检及OD等各项指标达标后即获得摇瓶液体菌种。⑤将葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、苹果酸钠、酵母粉、水按5％∶0.2％∶0.1％∶

5、0.2％∶1.0％∶93.5％的重量百分比配制成二级菌种培养基，并经121℃±1℃15min±1min蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，后降温至37℃±0.5℃接入摇瓶菌种，接种量为0.1％±0.02％；同时将经过0.25～0.3Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐；此时通风1∶0.2～0.4v/V.min，pH6～8，压力0.03～0.1MPa，培10h~12h，经菌种镜检及OD等各项指标达标后即获得二级菌种；⑥将葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、苹果酸钠、酵母粉、水按15％∶0.2％∶0.1％∶0.1％∶0.8％∶83.8％的重量百分比配制成发酵培养基，经121℃±1℃、15min±1mi

6、n蒸汽灭菌后泵入发酵罐，后降温37℃±0.5℃接入二级菌种，接种量为10％±0.5％；同时在上述步骤①中保压、无菌空气输入的条件下，将经120±1℃、8min蒸汽灭菌后50～70g/dL的葡萄糖液与0.2％±0.02％苹果酸钠同时进行连续流加；此时通风比为1∶0.3～0.6v/V.min，pH6～8，压力0.04MPa～0.1MPa，发酵50h～60h进行培养；当产苷达到55±2g/L时，即获得次黄嘌呤核苷发酵液。三.提取含次黄嘌呤核苷的RNA1・从枯草芽孢杆菌GDIR-1005中提取含次黄嘌呤核苷RNA（Trizol法处理）Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织

7、中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶.Trizol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化DNA及标准化RNA的生产十分有用。<参考步骤>匀浆处理发酵菌液经离心（3000r/min,5min）后，收集下层物，加入Trizol试液，反复吸打，用匀浆仪处理。将匀浆液在室温（15~30℃）放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。每使用1mlTrizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，