同种异体骨髓间充质干细胞治疗大鼠慢性阻塞性肺疾病

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1、性也较低，低表产生排斥反应。肺组织。目前对于慢性阻塞性肺疾病的治疗仅仅停留在缓解、改善的水平上，未能从根本上解决问题。本实验基于MSCs这些特性进行干预治疗，采用同种异体MSCs进行输注，研究MSCs治疗大鼠COPD的效果。．实验方法第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定实验在无菌条件下分离大鼠肱骨、股骨，用无血清培养基冲出骨髓，离心后接种含10％胎牛血清(FBS)的DMEM／F12培养基中，按2XlOe／cm2密度接种于培养瓶中，置于孵箱中培养。48h后半量换液，第五天全量换液，待细胞生长至80-

2、90％融合时，0．25％胰酶消化传代。取生长状态良好的第三代骨髓间充质干细胞倒置显微镜和瑞士一吉姆萨染色观察细胞形态，流式细胞术进行细胞周期分析，用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD29及C044的表达，进行细胞鉴定。第二部分大鼠慢性阻塞性肺疾病模型的建立选取10只雄性SD大鼠随机分为两组，即对照组和模型组。模型组大鼠烟雾暴露80天，对照组常氧下饲养。80天后，水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉插管取血lml送血气分析；苏木精一伊红染色(HE染色)观察大鼠肺部病理改变；平均内衬间隔(MLT)及

3、平均肺泡数(MAN)评估肺气肿程度。第三部分MSCs治疗大鼠慢性阻塞性肺疾病效果的研究Ⅱ硕士学位论文选取15只雄性SD大鼠随机分为三组，即对照组、模型组和治疗组。模型组和治疗组大鼠烟雾暴露80天，对照组常氧下饲养。其中治疗组大鼠在烟雾暴露80天后每只大鼠每周注射一次间充质干细胞，数量为3．6×106个，连续四周进行治疗，模型组和对照组大鼠同期尾静脉注射同等体积的生理盐水。常规饲养大鼠1月后，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉插管取血lml送血气分析；提取大鼠血清，制备肺组织匀浆，采用硫代巴比妥酸和黄嘌

4、呤氧化法分别检测血清和肺组织中MDA含量和SOD活性；行支气管肺泡灌洗，测支气管肺泡灌洗液中(BALF)自细胞总数及分类计数细胞；苏木精一伊红染色(HE染色)评估大鼠肺部病理改变，用平均内衬间隔(MLT)及平均肺泡数(MAN)评估肺气肿程度；从生理学、形态学、生化学等水平探讨MSCs是否具有治疗慢性阻塞性肺疾病的作用。第四部分MSCs向慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织趋化的研究用PKH26标记P3代MSCs，荧光显微镜下观察细胞。瑞士一吉姆萨染色观察PKH26对细胞形态的影响；检测标记后的MSCs的生长曲线

5、以了解PKH26对细胞的增殖的影响。分别经尾静脉输入PKH26标记后的MSCs3．6×106个到CoPD及正常大鼠体内，同时输入同等量未标记的MSCs至O另一组COPD大鼠体内作为阴性对照。一周后，处死大鼠，制作肺组织冰冻切片。荧光显微镜下观察。取大鼠肺组织，研磨后经300目筛网过滤，取肺组织1x106个细胞制作悬液涂片，在荧光显微镜下观察并计数，以探讨MSCs能否向慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺组织中趋化。统计学方法实验资料结果用均数±标准差(；±曲表示，选取检验水准为a=O．05，采用SPsSl3．0统

6、计软件包进行统计分析。模型评价采用两独立样本t检验(IndependentSampiesT—Test)；评估治疗效果的组间比较用单因素方差分析(One—WayANOVA)。标记后的细胞及未标记细胞随时间的增殖变化用配对样本t检验(PairedSampiesT-Test)；用Levene进行方差齐性检验，组间两两显著性比较方差齐采用LSD法，方差不齐用DunnettT3。IH摘要结果第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定①本实验分离的骨髓间充质干细胞于48h后贴壁生长，全量换液后可见细胞呈星形、多边形

7、和不规则形；10天左右时，细胞即可融合近80％。传代培养后细胞形态基本上趋于一致，经瑞士一吉姆萨染色后光镜下见细胞呈梭形，核圆，色紫蓝，位于细胞中央，胞质肥大，胞膜清晰；②流式细胞术证明GO+G1期的细胞约占80％以上，说明MSCs在体外具有只增殖不分化的特点；’③经流式细胞仪检测，CellQuest软件分析，结果显示第3代MSCs的特异性表面标志物：CD34一／CD45一／CD29+／CD44+，CD29+阳性率为99．9％，CD44+阳性率为97．8％：结合以上说明本实验培养的细胞为间充质干细胞。

8、第二部分大鼠慢性阻塞性肺疾病模型的建立①血气分析：检测动脉血氧分压(P倪)显示对照组和模型组分别为：83．00±6．94、72．20±5．404mmHg，模型组氧分压显著低于对照组(t=2．740，P=-O．025)；二氧化碳分压(PC02)分别为37．oo±3．16、40．8硕士学位论文第三部分MSCs治疗大鼠慢性阻塞性肺疾病效果的研究①观察大鼠的一般状态：对照组大鼠在实验过程中进食正常，毛发光滑，生长良好，无明显的呼吸道症状。模型组大鼠逐渐出现毛发脱