抗除草剂bar基因对小麦的遗传转化

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1、第一章文献综述1．1根癌农杆菌的生物学特·性及致瘤机理利用基因工程技术把外源基因导入植物细胞是现代遗传育种的重要途径。目的基因转化，并整合到受体植物细胞基因组中是植物基因工程的主要环节【1．21。经过近十多年的研究已建立了多种基因转化系统【3】，获得了一批有价值的工程菌株[4-6]。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)Ti质粒基因转化系统是目前研究最多、理论机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径[71。第一批能表达外源功能基因的转基因植物是用农杆菌介导转化获得的【哪。迄今所获得的近200种转基因植株中80％以上是利用

2、根癌农杆菌转化系统产生的19-“J。农杆菌属，也称土壤杆菌属(Agrobacterium)，和根瘤菌属(Rhizobium)是同属于根瘤菌科(Rhizobiacease)的革兰氏阴性菌。土壤杆菌属有4个种，即根癌农杆菌(4．tumefaciens)、放射形农杆菌似．radiobacter)、毛根(发根)口．rhizogenes)农杆菌和悬钩子农杆菌口．rubO。其中，根癌农杆菌根据其诱导植物细胞产生的冠瘿碱种类不同可分为三种类型的根癌农杆菌，即章鱼碱型(octopinetype)、胭脂碱型(nopalinetype)、农杆碱型(agropine

3、type)。土壤杆菌属(Agrobacterium)都是土壤习居菌，主要生活在曾被多种植物生长过的土壤中，好氧，但也能生长在低氧压的植物组织中，最适温度25．30℃，PH生长范围4．3．12．0，最适PH范围6．0．9．0。农杆菌侵染时，细菌通过原有的病斑或伤口进入宿主组织，但细菌本身不进入宿主植物细胞，只是把Ti质粒的DNA片段导入植物细胞的基因组中，鉴定菌株时，必须重新通过组织刺伤接种试验来证实。农杆菌细胞呈杆状，O．8x!．5-3．0urn,以l-4根周生鞭毛进行运动。如果鞭毛仅为1根，则侧生比极生更为常见，常有纤毛，不形成芽孢，革兰氏染

4、色呈阴性。在含碳水化合物培养基上生长的菌株常带有丰富的胞外多糖粘液。菌落无色素，随着菌龄的增加，光滑的菌落逐渐变成有条纹，但也有许多菌株生成的菌落呈粗糙型。根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中，据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根癌农杆菌敏感。裸子植物对该菌同样具有敏感性，能诱发肿瘤。一般认为单子叶植物对农杆菌无敏感性，但现在许多实验证明，对单子叶植物也有侵染能力【m121。农杆菌和宿主细胞之间存在化学信号传递、遗传转化及相关代谢活动。①损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号；②这些化学诱导物透过农杆菌的细胞膜，活化virA基因和

5、VirG基因，再诱导Vir区的其他基因；③vir基因活化后，作用于T．DNA的加工和T．DNA的转移；(荟)T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上；⑤T-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素；⑥农杆菌Ti质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基2抗除草剂bar基因对小麦的遗传转化因(ocs)。该基因启动合成各种酶，分解植物细胞产生的冠瘿碱作为唯一的碳源和氮源；⑦冠瘿碱促进农杆菌的附着及激活仃a基因有利于Ti质粒的接合转移，扩大侵染范围；⑧农杆菌基因组ehr基因参与农杆菌对植物细胞的侵染附着过程‘”之o】。根癌农杆菌附着于植物细胞是发生在侵染的最早

6、阶段，而且是极其迅速的过程。随后，农杆菌便会产生出细微的纤丝而将自身缚附在植物细胞壁的表面，同时别的细菌也会被包陷在这些丝组成的网络之中，最终在植物细胞上出现细菌集结。必须指出，根癌农杆菌并不“侵入”到植物细胞中去。实验证明，只有在创伤部位生存了16小时之后的菌株才能诱发肿瘤，这一段时间称之为“细胞调节期”。在调节期内，为遗传转化所必须的细菌功能已被诱导出来，即农杆菌Ti质粒基因被活化。在细菌的附着过程中，有毒的和无毒的各种农杆菌互相竞争植物细胞壁表面数量有限的附着位点。竞争中，如果无毒的农杆菌先于有毒的农杆菌接合到附着位点，就不会形成瘤，反之

7、则会形成肿瘤。根癌农杆菌附着后，便将它的Ti质粒的一部分DNA导入植物细胞，并致使正常植物细胞转化成肿瘤细胞进而形成冠瘿病【2l】。1．2植物基因转化受体系统的建立建立一个好的受体系统是实现基因转化的先决条件，关系到基因转化的成败。受体系统的建立主要依赖于植物组织培养技术，但正如前面所述，它与一般植物的组织培养相比要求更高。从受体系统建立的内容来看也比一般组织培养复杂，其包括外植体的选择制备、高频再生系统的建立、抗生素的敏感性试验及农杆菌的敏感性试验(亦农轷菌介导转化植物组织)等。1．2．1建立高频再生系统的条件“”高频再生系统必须具备四个条件

8、：①外植体的组织细胞具有再生愈伤组织和完整植株的能力，而且最好是外植体能直接分化芽；②芽的分化率达90％以上；⑧易于离体培养，具有高度可重复性；④体细