mhcc97h肝癌细胞中hgf诱导vegf表达分子机制的研究

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1、论文独创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构己经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。作者签名：论文使用授权声明本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此导师签名：毫I壅差．日期：生笸五中文摘要肝癌是我国农村第二位、城市第三位癌症。中国

2、肝癌死亡率为20．4／10万，占全部恶性肿瘤死亡的18．8％。肝癌的血供丰富，其生物学特性包括高度血管浸润及转移倾向，导致该疾病的预后不良。肝癌复发与转移是一个多步骤、多环节的过程，其分子机制涉及癌基因、抑癌基因、转移相关基因、生长因子及其受体、黏附分子、细胞外基质、血管形成等多个环节。近年来，对肿瘤血管的研究是一大热门。研究表明肿瘤的生长、转移与肿瘤血管形成密切相关，血管形成是肿瘤生长、侵袭、转移的基础。当肿瘤长到直径超过2mm3，若要继续生长必须依赖新生血管的生成。在正常情况下，血管内皮与周围基质以及影响血管生成的各种细胞因子和生长因子之

3、间的相互作用受到严格的时空调控，然而在肿瘤发生发展过程中，病理性的血管发生却脱离了正常的调控系统，无限制的异常持续，所以多种参与调节血管发生的细胞因子在肿瘤中表达。血管生成因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)被认为是最强的血管形成因子，VEGF表达水平反映了肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移和血管构建的水平，直接反映肿瘤生长的速度和转移的倾向。VEGF能诱导微血管形成，降解血管内皮细胞的基质，削弱血管的屏障作用，致使新生血管基底膜缺损加重，更利于癌细胞的进入，为肿瘤的转移创造条件。多种因素影响VEGF表达，

4、包括细胞因子等。多种细胞因子之间存在信息交流(crosstalk)现象，直接或间接参与调节了VEGF基因的转录和翻译。VEGF表达的调节是一个非常复杂的过程，它可以被多种因素在不同水平调节，包括在基因转录、mRNA稳定以及mRNA转录水平的调节。许多血管生成因子本身就是有力的VEGF基因表达的诱导剂，这些因子很可能是通过诱导或放大VEGF的合成来发挥它们的促进血管生成作用的。肝细胞生长因子(HepatocymGrowthFactor，HGF)是由基质细胞产生的一种多功能生长因子，它在正常或肿瘤细胞中主要以旁分泌方式发挥作用。HGF主要通过激活

5、细胞表面的受体c．met的酪氨酸激酶磷酸化发挥生物学作用。HGF不仅在正常肝细胞增值过程中起着重要作用，还具有促进肝癌细胞增值、细胞运动及血管形成等多种功能。HGF和VEGF对血管内皮细胞增殖和毛细血管形成均有促进作用。HGF可以在多种细胞中表现出强有力的上调VEGF表达作用。并且HGF和VEGF具有协同作用。HGF与VEGF之间相互作用的分子机制尚不清楚，理解这一机制，可以为控制肝癌的血管形成提供新的理论依据及治疗策略。MHCC97H是从MHCC97细胞系中进一步分离出的具有高转移潜能的肝癌细胞株。该细胞株来源于肝癌患者，其生物学行为接近临

6、床实际情况，因此，我们选用该细胞株作为研究HGF诱导VEGF的表达的分子机制的平台。第一部分肝癌MHCC97H细胞中肝细胞生长因子对VEGFmRNA、蛋白质表达及其转录因子spl磷酸化的影响一、HGF对MHCC97H细胞VEGFmRNA的影响：HGF主要通过激活细胞表面的受体c．Met的酪氨酸激酶磷酸化发挥生物学作用。给与不同浓度HGF培养16h后，随HGF刺激浓度增加VEGFmRNA表达量增加。分别给予20ng／ml和40ng／mlHGF作用后HGF组VEGFmRNA的表达量(1．04±0．16及1．20±0．18)升高，与对照组(0．95

7、±0．12)比较无统计学意义(P=O．089及0．17)。60ng／ml、80ng／m1HGF作用后HGF组VEGFmRNA的表达量分别为(1．40±0．21及2．68±O．43)，均较对照组(0．95±0．12)明显升高(P=O．026及0．0034)，但60ng／m1与80ng／m1浓度HGF刺激删CC97H后无的VEGFmRNA表达无统计学差异(，％=O．19)。二、WesternBlot蛋白印迹法分析不同浓度HGF对MHCC97H细胞VEGF蛋白表达的影响：在正常培养的肝癌MHCC97H细胞中检测出有VEGF蛋白的表达，用20ng／m

8、l、40ng／ml、60ng／ml、80ng／ml不同浓度HGF培养MHCC97H细胞24h后，VEGF蛋白表达量随HGF刺激浓度增加相应增加。其中20ng／m1、