多重连接依赖性探针扩增技术在产前诊断中的应用

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1、多重连接依赖性探针扩增技术在产前诊断中的应用刘青松1,2朱兴春1,2唐中1,2(通讯作者)(1川北医学院医学检验系四川南充637000；2川北医学院附属医院检验科四川南充637000)【中图分类号】R319【文献标识码】A【文章编号］2095-1752(2012)03-0135-03产前诊断是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查,对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患胎的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出牛缺陷率，提高优牛质量和人口素质。多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术是在多重扩增探针杂交(MAPH)技术的基础上改进而来，基木原理

2、是针对基因组内拷贝数变异(CNV)对可与样木DNA正确杂交并被连接酶连接的探针进行扩增和半定量分析，具有精确度高、重复性好、操作简便及通量大等特点。MLPA己广泛应用于染色体数目异常、遗传性疾病基因缺失重复、单核昔酸多态性、甲基化等多个研究领域等。随着MLPA不断被改进，目前已成为临床上常用的产前诊断工具之一，因此木文就其在产前诊断中的应用做一总结。1MLPA原理MLPA是集DNA杂交技术、PCR技术、连接酶反应技术和毛细管电泳技术与一体，具有高特异性、高灵敏性和高通量的一种分子生物学技术。MLPA最大特点在于探针的设计。探针包括两个长短不一的荧光标记

3、寡核昔酸片段。短探针⑸端探针)为化学合成而来，长约50-60bp,包括一段却端与靶序列完全互补的杂交序列和一段宁端长19nt的共同PCR±游引物互补序列。长探针⑶端探针)是经M13噬菌体衍牛法制备而来，长约60-450bp,包括一段宁端与靶序列完全互补的杂交序列和一段引端23nt共同PCR下游引物相互补序列及一段长度不一的中间填充序列。由于填充序列长短不一，连接后总长度在130nt-480nt之间，相邻两探针扩增产物长度相差6-9nt,因而能在一个反应体系中，仅用一对引物即可扩增达45个不同的核昔酸序列。由此可见，MLPA所得到了产物不是育•接针对原始

4、样本中存在的序列，而是由两条探针经连接反应形成的片段。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，连接反应才能进行，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。当连接反应完成，随后进行PCR扩增，产物经毛细管电泳，收集相应扩增峰。如果检测的靶序列发生突变、缺失或扩增，相应探针的扩增峰便会消失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或突变存在。2MLPA在产前诊断中的应用2.1胎儿染色体非整倍体检测染色体非整倍体改变在临床上十分常见，传统的检测方法有胎儿标本的核型分析和

5、荧光原位杂交技术。然而核型分析具有细胞培养周期长，甚至培养失败而得不到分析结果的风险；荧光原位杂交技术价格高，且只能针对部分染色体。MLPA作为新发展的产前诊断技术代表，因其具有分析周期短、高通量等特点，在其发展初期就应用于临床，尤其是对非整倍体变异的检测。Slater[1],Hochstenbach⑵和Gerdes⑶就采用商业化MLPASALSAP001试剂盒对非整倍体进行产前诊断。最近，vanOpstal[4],Gerdes[5],Kooper[6,7]和Boormans[8]釆用商品化MLPAP095试剂盒对10110分未经培养的羊水标本和252

6、5份绒毛标本进13,18,21,X和Y染色体拷贝数进行分析。发现MLPA不仅可对非嵌合体变异能够做出准确诊断，对于部分三体的嵌合体变异也能做出相应的检岀。国内，江雨⑼等采用MLPA技术对179例羊水、90例脐带血和13例绒毛标本进行13号、18号、21号和X、Y染色体进行检测，共发现染色体异常标本17例，其中21三体7例、18三体5例、45‘X单体3例、13三体1例和47,XYY三体1例。2.2先天性心脏病检测先天性心脏病是常见的胎儿临床表现，其发病机制复杂，涉及基因众多。目前，临床对先天性心脏病的诊断是通过经胸心脏彩色超声、胸部x线、心电图以及临床症

7、状和体征进行诊断。这些方法可以帮助判断畸形部位或脏器功能，但不能提供病因学方面的信息，也无法对再次妊娠的风险进行精确评估。因此有必要对先天性疾病的靶基因进行进一步的检测。Jeroen[10]等采用MLPA技术对与先天性心脏病有关10q23.2.q23.31微缺失进行检测，并确定了BMPR1A为主要效应基因。该研究团队认为BMPR1A的缺失与房室间隔缺损相关。国内，陈瑛[11]等采用MLPAP250商品化试剂盒对100例散发的先天性心脏病标本（40例产前超声诊断为心脏畸形的胎儿，60例为先天性心脏病患儿）22qll微缺失情况进行了检测，发现胎儿标本中有2

8、例为22qll微缺失，先天性心脏病患儿有1例22qll微缺失，3例检测出22qll微缺失的患儿