多重连接探针扩增(mlpa)的原理及其应用

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1、多重连接探针扩增技术及其应用深圳市天大生物医疗器械有限公司苏海静副总经理MLPA技术简介主要内容MLPA技术特点与主要应用领域MLPA技术工作流程数据分析(Coffalyser的使用)MLPA技术简介MLPA:多重连接探针扩增技术主要应用领域：多重检测人类基因组序列中微小的拷贝数变异该技术于2002年首次发表：SchoutenJPetal:NucleicAcidsRes.30:e57。发表的MLPA技术相关的文章超过一千篇。每年运行的MLPA测试超过一百万次。使用MLPA技术的实验室超过一千个并

2、分布于在80个不同的国家。荷兰MRC公司提供MLPA试剂盒包括了300多种的应用领域：--人类基因组学--分子细胞遗传学--肿瘤诊断学多重连接探针扩增技术原理1.变性&2杂交PCR上游引物杂交序列PCR下游引物上下游杂交探针彼此相邻，由热稳定的连接酶连接。3.连接目标序列BX5’5’3’YX5’5’3’目标序列AY5’3’目标序列A目标序列B5’3’间隔序列(对于不同探针长短不同)4.PCR每种探针的扩增产物都有自己特异的标志性长度（130-480bp）。5’3’5’3’XY5’3’XY5’3’所

3、有连接产物均由同一对引物进行PCR扩增。5.毛细管电泳分析扩增产物通过与对照DNA标本比较相同片段长度峰高的不同来确定目标序列的对拷贝数变化。Schouten,J.P.etal.Nucl.AcidRes.30,e57.5’5’5’EcoRVSphIXbaIBsmI“Stuffer”sequencePCRprimersequence(vector:blueplaques)EcoRVSphIXbaIBsmI“Stuffer”sequencePCRprimersequence(clone:whitepl

4、aques)EcoRVBsmI人工合成的杂交序列被克隆到来源于M13的SALSA载体上。每个SALSA载体都包括了一段不同长度的间隔序列。通过克隆获得单链DNA。将两个短的寡核苷酸序列与单链DNA退火，从而获得带BsmIandEcoRV位点的双链DNA。Hybridisingsequence经EcoRVandBsmI酶切后,可以获得85-440nt长的探针序列.“Stuffer”sequenceHybridisingsequencePCRprimersequence右侧杂交探针的制备MLPA工作原

5、理特点1、检测对象为和两条MLPA探针完全配对的样品DNA序列；2、扩增对象是杂交在样品上的两条探针由连接酶进行连接之后的产物；3、不同基因的连接产物长度不同；4、多重的连接产物能够被同一对引物扩增；PCR具有高度的同步性；5、扩增产物（大小一般为130-500nt)用于毛细管电泳分析；6、基因拷贝数变化直接体现在毛细管电泳结果的峰面积差异；7、基因点突变体现在扩增峰缺失；8、所需仪器只需普通PCR仪和一台测序用的毛细管电泳仪。耗时在24小时以内。MLPA工作流程MLPA的操作流程变性样品DNA在

6、98度下加热5分钟。杂交往变性后的样品中加入SALSA探针混合液和MLPA缓冲液。混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。连接在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。PCR加入引物，dNTP和DNA聚合酶。PCR反应。毛细管电泳将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。分析结果。P002;5ng.DNA10ng.DNA20ng.DNA50ng.DNAX=引物二聚体X=引物二聚体MLPA质控片段可以识别DNA样品浓度是否合适每个ML

7、PA探针混合液都包括质控片段当DNA样品量不足时，4个质控片段（64-70-76-82nt）的峰会产生很高的信号当DNA样品变性不完全时，两个探针(88-96nt)会给出警示信号.X染色体(100nt)和Y染色体(105nt)片段可以指示样本是否置换.4xQ-fragmentsXY2xDNADenaturationcontrolfragmentsTE,98oC.TE,94oC.TE,98oC.TE,82oC.TE,98oC.TE,76oC，并不是所有的染色体区域都变性DNA样本的要求MLPA反应要

8、求基因组DNA的使用量范围为20-500ng。为了减少差异，尽量使用与待测样本来源相同和提取方法一致的样本作参照。长时间的存储和反复冻融可能会影响样本的质量和MLPA的检测结果。一些污染物可能会影响MLPA的结果（如影响模板变性或PCR扩增）。DNA变性Tm依赖于GC含量.Tm受盐离子浓度影响，当盐浓度提高10倍时，Tm可以提高10倍.DMSO/甲酰胺可以降低Tm.其它的化合物?TE,98oC.TE+50mMKCl;98oC.TE,98oC.TE+50mMKCl;94oC.Thep