应用taqman探针技术检测mthfr基因c677t与a1298c多态性

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1、应用TaqMan探针技术检测MTHFR基因C677T与A1298C多态性摘要：目的探讨一种快速、准确运用于临床检测MTHFR基因多态性的方法。方法提取43例胃癌患者的外周血基因组DNA,用TaqMan探针技术对MTHFR基因的C677T和A1298C两个多态性位点进行分型，并采用直接测序法对TaqMan探针分型结果进行验证。结果43例样本的MTHFRC677T基因型分别为14例CC、23例CT和6例TT；A1298C基因型为24例AA、18例AC、1例CC,两种分型方法结果一致。结论本研究选用的TaqMan探针分型方法结果准确可靠,能够用于MTHFR的C677T和A12

2、98C两个多态性位点分析。关键词：TaqMan探针；MTHFR；多态性；DNA测序；胃癌胃癌(Gastriccancer)是世界范围内的高发肿瘤之一［1］。近年研究表明，低叶酸水平可增加包括胃癌在内的许多肿瘤发生的危险性［2］。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)是叶酸代谢途径中的一关键酶,MTHFR参与的体内同型半胱氨酸(Hey)和甲硫氨酸之间的循环反应，反应中生成的S腺昔甲硫氨酸(SAM)是体内代谢唯一的甲基供体，涉及DNA的修复与合成，影响DNA代谢，与许多肿瘤化疗药物的疗效相关。MTHFR的活性

3、很大程度上可能受基因多态性的影响，从而影响疾病的发生和药物的疗效。MTHFR基因C677T和A1298C为两个常见的多态性位点，有研究表明该位点的基因多态性会导致MTHFR酶活性的改变[3],可能导致患者之间出现较大的个体差异。因此，测定MTHFR的基因型对疾病的预防和合理用药有重要的意义。现已有的MTHFR基因多态性的研究，大多数采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术，该技术不仅费时，且易污染造成假阳性。不适宜用于临床检测。本研究旨在探讨一种可用于临床快速准确检测MTHFR基因型的方法，故选用TaqMan探针技术对MTHFR的C677T和A129

4、8C两个多态性位点进行分型。1资料与方法S31・1一般资料经CT.MRI或病理组织学活检确诊的胃癌患者43例，来源于昆明医科大学第一附属医院，收集样本人群的外周静脉血2mL。采用GenomicDNAPurificationKit(PROMEGA公司)对基因组DNA进行提取，使用Nanodrop2000测定DNA的浓度和纯度。1.2TaqMan探针技术检测MTHFR基因C677T和A1298C位点的多态性TaqMan探针试剂由ABI公司为MTHFR基因C677T(SNPID：rsl801133),A1298C(SNPID：rsl801131)多态性设计的TaqManSNP

5、分析试剂，每个位点的TaqManSNP基因分型试剂中，含有两条MGB探针。MTHFRC677T—条以VIC荧光标记碱基G,对应样本基因突变位点C；一条以FAM荧光标记碱基A,对应样本基因突变位点ToMTHFRA1298C一条以VIC荧光标记碱基G,对应样本基因突变位点C；一条以FAM荧光标记碱基T,对应样本基因突变位点A。探针序列，见表1。MTHFRC677T及A1298C多态性real-timePCR采用25uL反应体系：40XSNPGenotypingAssayMix：0.625uL；TaqMan2XPCRMasterMix：12.5uL；DNA模板：1uL；ddH

6、20：10.875uLo探针检测在BIO-RADIQ5实时荧光PCR仪上进行。反应条件为：95°C预变性10min；95°C,15s；60°C,1min,共40个循环。由于仪器的限制，本研究使用的BIO-RADIQ5实时荧光PCR仪中没有VIC荧光检测通道，我们选择了HEX荧光通道替代，两种荧光相差lnm波长。1.3DNA测序法验证TaqMan探针技术检测MTHFR基因多态性1.3.1目的片段的扩增设计MTHFRC677T及A1298C两个多态性位点的测序引物（Invitrogen公司合成），引物序列，见表2。2结果2.1Taqman探针基因型分析MTHFRC677T和

7、A1298Creal-timePCR散点图基因分型结果分别，见图1、图2。2.2DNA测序验证采用LansergeneSeqMan软件分析测序结果。1.3MTHFR基因多态性分型结果43例样本MTHFRC677T基因型分别为野生纯合型CC14例(32.5%).突变杂合型CT23例(53.5%)及突变纯合型TT6例(14.0%)。A1298C基因型分别为AA24例(55.8%).AC18例(41.9%)、CC1例(2.3%)o本研究中，TaqMan探针技术检测及DNA测序验证,两种检测方法得到的基因分型结果一致。3讨论中国是个胃癌高发的国家