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1、UPLC—MS/MS测定青蒿素代谢抑制剂猫眼草黄素和大鼠血浆药代动力学探究[摘要]目的:建立UPLC-MS/MS测定大鼠血浆中青蒿素代谢抑制剂猫眼草黄素(chrysosplenetin,CHR)的体内分析方法,并考察其药代动力学参数。方法:血浆样品以乙月青沉淀蛋白;采用Shim-packXR-ODSC18色谱柱(2.0mmX100mm,2.2um),以地西泮为内标,流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液(87:13);质谱条件为电喷雾离子源(ESI源),正离子模式检测;样品分析时间为2mine结果:CHR在5〜5000ug・L-l线性良好(r=0.9993),提取回收率为69.
2、0%〜81.2%,日内、日间精密度和准确度符合要求°CHR口服吸收差,存在双峰甚至多峰现象;静脉注射消除半衰期短,低、中、高剂量组tl/2分别为(17.01±8.06),(24.62±4.59),(28.46±4.63)min。结论:该方法特异、快速、灵敏,可用于CHR药代动力学分析。[关键词1UPLC-MS/MS;猫眼草黄素;药代动力学;血浆;大鼠猫眼草黄素(chrysosplenetin,CHR)是一种多甲氧基黄酮,广泛存在于黄花蒿[1-2]、泽漆(俗称猫眼草)、岩筋菜、细花线纹香茶菜[3]等多种植物中。研究人员[4]发现CHR对手足口病主要病原体肠道病毒71(EV7
3、1)具有较强的抑制活性,能有效抑制病毒RNA的合成,且对多种人肠道病毒都表现出相似的抑制活性。此外,文献还报道[5]黄花蒿叶片中的多甲氧基黄酮如CHR、紫花牡荆素等可显著提高青蒿素的抗疟活性;本课题组也发现CHR可通过显著抑制与青蒿素代谢相关的CYP450酶亚型的活性,从而提高青蒿素的体内抗疟活性,确定了青蒿素-CHR复配抗疟比例为1:2,显现出良好的青蒿素肝代谢抑制剂的开发前景。但CHR的溶解性极差,其药代动力学过程可能存在着难溶性药物共有的特点和缺陷,本实验旨在建立简单、快速、可靠的UPLC-MS/MS,以评价CHR在大鼠体内的药代动力学过程,为青蒿素代谢抑制剂CHR
4、的进一步开发利用奠定基础。1材料超高效液相色谱仪(日本岛津公司NexeraUHPLCLC-30A型),质谱(美国AE公司API4000型液相色谱串联质谱联用仪),配有电喷雾离子化源(ESI)和AnaLyst1.5.1分析操作软件;低温高速离心机(Z323K型,德国HERMLER公司);分析天平(AE240型,瑞士MettLer-ToLedo公司)。CHR(纯度398%,由本实验室制备),地西泮(中国食品药品检定研究院,批号115-9302),乙睛、甲醇、甲酸均为色谱纯,Fisher公司;去离子水(Milipore)。SD大鼠,30只,雌雄各半,体重(210±20)g,由宁
5、夏医科大学实验动物中心提供。2方法2.1对照品溶液配制CHR标准溶液的配制:精密称取CHR对照品10mg,置10mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,制成1g•L-1的储备液I,以流动相甲醇为稀释溶液,逐步将储备液I稀释成50mg・L-1的储备液II10mL,置于4°C冰箱内保存待用。内标地西泮溶液配制:精密称取地西泮10mg置于10mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,配制成lg・L-1的储备液III,以流动相甲醇为稀释液,逐步将储备液III稀释成为20ng・L-1的地西泮溶液10mL,放置4°C冰箱内保存待用。2.2色谱条件Shim-packXR-ODSC18
6、色谱柱(2.0mmX100mm,2.2Liin),ODSC18保护柱(2mmX5mm,2.2um),流动相为甲醇-0.1%甲酸溶液(87:13),柱温30°C,流速0.3mL•min-1,进样量10uL。2.3质谱条件离子化源为ESI源,电喷雾电压为4kV,离子检测方式为正离子检测,碰撞气压力为1.73X10-2Pa,喷雾压力为36V,加热温度为500°C,所用气体为氮气。CHR的m/z[M+HJ+375.5,定量离子m/z317.2;地西泮(内标)m/z[M+Hl+316.2,定量离子m/z为163.0,见图1。2.4血浆样品的处理精密吸取血浆100uL,置10mL具塞
7、玻璃离心管中,精密加入地西泮(20Pg-L-1)20uL,涡旋振荡30s,加入0.3mL的乙月青,涡旋振动3min,14000r•min-1,低温离心10min,吸取上清液,取10uL进样分析。2.5方法学考察2.5.1血浆标准曲线的制备取CHR储备液II以大鼠空白血浆为稀释溶液,配制成相当于血药质量浓度为5000,1000,500,100,50,20,10,5ug-L-1的CHR血浆溶液,分别以2.4项下操作,进行UPLC-MS/MS分析测定,以CHR浓度为横坐标,CHR与内标峰面积比为纵坐标,绘制标准曲线。2.5.2定量下