高抗菌活性纳豆芽孢杆菌的诱变筛选

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1、高抗菌活性纳豆芽孢杆菌的诱变筛选　　摘要以市场上常见的4种用于制作纳豆食品的菌粉（菌液）为出发菌，采用2种不同诱变剂（紫外线和亚硝基胍）在不同剂量下复合诱变处理，试验结果表明，原始菌株在紫外线照射时间为80s、NTG剂量为0.4mg/mL时，致死率分别为83%和87%。以此诱变条件对纳豆芽孢杆菌进行紫外线、NTG复合诱变，通过与指示菌共同涂布培养，以菌体的生长情况、菌落直径的大小以及抑菌圈直径为初筛标准，初筛出了60株抑菌效果较好的菌株。进一步通过管碟法复筛，得到1株具有较高抗菌活性的突变株L-23，抑菌圈直径可达27mm，传代培养10次后抑菌圈直径无显著变化，其抑菌

2、活性具有较好的遗传稳定性。　　关键词纳豆芽孢杆菌；抑菌；诱变；筛选　　中图分类号TQ920文献标识码A文章编号1007-5739（2016）17-0251-02　　AbstractInthisstudy，fourstrainsofBacillusnattowereseparatedandpurificatedfromthenattopowders.Inordertoimprovetheantibacterialsubstanceproduction，thefourstrainswasirradiatedbyUVandNTG.Theresultsshowedthatwh

3、enBacillusnattobeirradiatedbyUVfor80sorbetreatedby0.4mg/mLNTG，thelethalityrateswere83%and87%respectively.Aftertreatmentwithcompoundmutation，60stainswasscreenedoutaccordingtothegrowth8rateofbacteria，diameterofcoloniesandinhibittedbacteriacircles.Aftersecondaryscreeningwithslipmethodandcy

4、linder-platemethod，amutantstrain（L-23）wasselected，whichcangeneratea27mminhibittedbacteriacirclesandithasagoodstabilityingeneration.　　Keywordsbacillusnatto；antibacterial；mutation；screen　　随着近年食品中抗生素残留问题的日益突出，对安全、无残留、高效的天然防腐剂或微生态制剂的需求逐渐增加。细菌素是解决这一问题的重要途径。现已有许多细菌素被发现和研究，但在食品中应用较多的细菌只有Nisin和

5、纳他霉素（Natamycin），其他细菌素的应用研究较少。各国对纳豆菌不断深入的研究表明纳豆菌有较强的抗菌作用[1-7]，能用于工业生产，而优良菌株的选育是影响其产品质量的关键。因此，选育抗菌活性高、产生抗菌物质稳定的菌株有十分重要的意义。　　本试验采用紫外线和NTG这2种高效诱变剂[8]对纳豆芽孢杆菌进行复合诱变，以建立一套适合纳豆芽孢杆菌的高效筛选方法，从而筛选出具有较高抗菌活性的纳豆芽孢杆菌菌株，为今后继研究打下基础。　　1材料与方法　　1.1试验材料　　1.1.1菌种。纳豆芽孢杆菌菌粉[高桥?v藏公司（G）、日本成濑酰酵化学研究所（L）、长春市今泉宫城野纳豆有

6、限公司（C）、江大力通有限公司（J）]（后文中不同公司菌种分别用括号中相应大写字母代替）。指示菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureussubsp.）（试验室保存）。8　　1.1.2主要试剂。亚硝基胍（NTG日本东京TCR株式会社生产）。　　1.1.3培养基及试剂的配制。豆芽汁培养基：豆芽汁1000mL，蔗糖5%，pH值为自然条件。LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸提物5g，氯化钠10g，pH值7.2。肉汤培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL调pH值至7.0。管碟法检测抗菌物抑菌作用时加琼脂0.75%。肉汤豆芽汁混合培养基：蛋

7、白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，豆芽汁2%～10%调pH值至7.0。　　1.2试验方法　　1.2.1菌悬液制备。将保存的4种纳豆芽孢杆菌菌种移接到新鲜的豆芽汁培养基中，150r/min、35℃摇床培养12h。将菌液5000r/min离心5min，弃去上清液，再用无菌生理盐水洗涤2次，制成均匀的细菌悬液。　　1.2.2紫外线照射法诱变纳豆芽孢杆菌。选择功率为20W的紫外灯，照射距离30cm，照射前20min开启预热使紫外线强度稳定。将纳豆芽孢杆菌悬液3mL分别照射20、40、60、80、100、120s，照射时间结束盖上皿盖用黑袋