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1、基于三色荧光探针红花肾保护活性物质筛选探究［收稿日期］2014-02-10［基金项目］国家“重大新药创新”科技重大专项(2012ZX0930400)［通信作者］*赵筱萍，教授，博士生导师，Tel：(0571)86633138,E-mail：zhaoxiaoping@zcmu.edu.cn［作者简介］兰小红，硕士研究生，E-ma订：18657905023@163.com［摘要］该研究采用3种荧光探针FDA,MTR,Hoechst33342对盐酸阿霉素损伤的HK-2细胞进行标记，通过细胞荧光显微成像平台进行荧光图像采集及分析，建立了一种潜在的
2、肾保护活性物质筛选方法。应用该方法对红花的53个化学组分进行筛选，发现C17,C18,C193个组分对盐酸阿霉素损伤的HK-2细胞具有较好的保护作用，运用液相色谱质谱联用(LC-MS)技术对其进行定性分析，初步推测出8个化合物，軽基红花黄色素A,6-释基山奈酚-3-0-芸香糖-6-0-葡萄糖昔，6-释基山奈酚-3,6-二-0-葡萄糖昔或6-轻基山奈酚-6,7-二-0-葡萄糖昔，6-発基山奈酚-3-0-芸香糖昔，6-轻基山奈酚-3-0-葡萄糖昔或6-務基山奈酚-7-0-葡萄糖昔，芦丁，异桝皮素和山奈酚-3-0-芸香糖昔。与对照品比对后确认其
3、中4个化合物为异桝皮素、芦丁、山奈酚-3-0-芸香糖昔及释基红花黄色素A,并对这4个化合物的肾细胞保护作用进行了验证，发现均具有一定的肾细胞保护作用，其中异桝皮素的保护作用最强，且具有良好的量效关系。实验结果提示，异楣皮素、芦丁、山奈酚-3-0-芸香糖昔及務基红花黄色素A可能是红花发挥肾保护作用的活性成分。［关键词］荧光探针；肾保护；活性物质筛选；红花慢性肾病是一种常见的复杂性疾病，在我国成人中的发病率为10.8%,已成为影响我国公众健康的主要疾病之一［llo肾小管上皮细胞损伤是慢性肾病持续进展的重要因素［2］,因此，筛选对肾小管上皮细胞
4、具有保护作用的物质对慢性肾病治疗药物的发现具有重要意义。基于细胞荧光显微图像的多色荧光标记技术可以在一次筛选中获得待筛样品对细胞多方面的作用信息，是一种高效的药物发现方法［3］。本研究采用3种不同颜色的荧光探针FDA、MTR及Hoechst33342同时标记盐酸阿霉素损伤的HK-2细胞，构建了一种基于三色荧光探针标记的肾细胞损伤模型，并与LC-MS技术相结合，用于中药红花肾细胞保护活性物质的筛选研究，旨在为肾保护活性物质的快速发现提供一种新方法。1材料1.1仪器细胞荧光显微成像平台（浙江大学药学院药物信息学研究所自主研发）；Bio-Tek
5、ELX800酶标仪（Bio-Tek公司，美国）；C02细胞培养箱（Thermo公司，美国）；1300系列II级A2型生物安全柜（Thermo公司，美国）;AnkeLXJ-IIB低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）；Agilent1100型高效液相色谱仪，配二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、PDA检测器及LCQDecaXPplus离子阱质谱检测器（Finnigan质谱公司，美国）。1.2药物和试剂乙睛（色谱纯，Merck公司）；二甲基亚矶（dimethylsulfoxide,DMSO,百灵威科技有限公司）；甲酸（色谱纯，Tedia公司）
6、；二乙酸荧光素（fluoresceindiacetate,FDA）,Hoechst33342（Sigma公司）；MitoTrackerRedCMXRos（MTR,Invitrogen公司）；PenStrep（Gibco公司）；高糖DMEM基础培养基，FetalBovineSerum,TrypsinEDTA（Corning公司）;盐酸阿霉素（批号130509-200301）、芦丁（批号100080-200707）、密基红花黄色素A（批号111637-200905）购于中国食品药品检定研究院；盐酸川苇嗪（批号42763）购于阿拉丁试剂有限公司
7、；山奈酚-3-0-芸香糖昔（批号121109）、异桝皮素（批号130920）购于上海融禾医药科技有限公司；红花（产地新疆，批号120801）购于浙江中医药大学中药饮片有限公司，经浙江中医药大学中药饮片有限公司郑建宝主管中药师鉴定为菊科植物红花的干燥花。1.3细胞系人肾近端小管上皮细胞系（humankidneyproximaltubularepithelialcellline,HK-2,上海复祥生物科技有限公司)。2方法与结果2.1荧光探针标记HK-2细胞的浓度选择取对数生长期的HK-2细胞，以5000个/孔接种于96孔板，置于细胞培养箱中
8、孵育24h,使细胞贴壁。吸去旧培养液，每孔加入10011L含不同质量浓度梯度FDA(8,6,3,1.5,0.75,0.375mg•L-l),MTR(8,6,4,2,1,0.5mg•L-1)及H
