基于几丁质酶阻断的生物活性物质的筛选.pdf

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1、基于几丁质酶阻断的生物活性物质的筛选ScreeningStudyofBiologicalActiveSubstanceswiththeInhibitionofChitinase2011年4月合肥工业大学本论文经答辩委员会全体委员审查，确认符合合肥工业大学硕士学位论文质量要求。主席：。呖J颈：新弋，71＼研翔导师：弘,-p；萼i扎答辩委员会签名铷矽薯膨∥强铆钠杈酗拍天椰：=．刁枷17令他二芝大京到数援独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经

2、发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得．金罡王些太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：刘碱釉签字日期：弘fJ年妒≥。日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解金目曼工些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权金月曼王些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)

3、学位论文者签名：剐嗍牺导师签名：弓钒1譬j叭。导师签名：弓铷K』V＼签字日期：弘Jf年中月弓oft签字日期：加1『年歹月午El学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：基于几丁质酶阻断的生物活性物质的筛选摘要几丁质酶在真菌和昆虫的生理和发育过程中起着关键作用，该酶本身及其酶抑制剂是获取生物农药的重要途径。论文首先分别从蚕蛹和棉铃虫蛹体内提取几丁质粗酶，经过硫酸铵分级沉淀和SephadexG．150分离得到几丁质酶。用SDS．PAGEi贝0得两酶的分子量分别为88kDa、75kDa；水解胶体几丁质的Km值分别为22．3pmol／L、41

4、．09mol／L：酶反应的最适温度分别为45℃和50。C，最适pH值均为6．0；高浓度的Mn2+对两酶均有较强的激活作用，而Cu2+、SDS对两酶都有较强的抑制作用；两酶对所选用的真菌均有抑制作用。以棉铃虫蛹几丁质酶作为筛选靶标，通过平板透明圈法和DNS比色法进行几丁质酶抑制剂的筛选，从全国各地共34份土样中筛选出以A0901“菌株为代表的具有几丁质酶抑制性的活性菌株33株。对33株活性菌株发酵液中的活性物质成分的分离纯化技术进行初步探索，比较系统地研究了A09014菌株活性物质的分离纯化。采用活性追踪的方法对其进行分离，通过乙醇沉淀、Sevage

5、试剂除蛋白及SephadexG．100凝胶色谱得到一个纯的活性物质，经HPLC检测显示在保留时间l5min左右为一单峰，DNS比色法验证其抑制率为54．2％，红外、质谱、元素分析确定其为一个多羟基的化合物。经形态、培养特征以及16SrDNA序列聚类分析，将菌株A090l撑鉴定为链霉菌属。并确定其发酵条件为：可溶性淀粉作为碳源，KN03作为氮源，发酵培养基初始pH值调至6．0，最适温度28℃，接种量为10％，培养时间6d，发酵液抑制效果最佳。关键词：几丁质酶抑制剂分离纯化链霉菌ScreeningStudyofBiologicalActiveSubst

6、anceswiththeInhibitionofChitinaseAbstractTheimportanceofchitinasesinthephysiologicalanddevelopmentalprocessesoffungusandinsectsmadethemselvesandtheirinhibitorsimportanttargetsforbiologicalpesticides．ChitinaseswereisolatedfromBombyxmoriandHelicoverpaarmigeraandpurifiedtoelectro

7、phoretichomogeneitybythestepsofammoniumsulfateprecipitation，SephadexG-150columnchromatographyandSDS—PAGE．Onebandof88kDawasobservedforBombyxmori，andtheotherbandof75kDawaspresentinHelicoverpaarmigera．Kmsofchitinasesinsilkwormandbollwormwerecalculatedtobe22．3J_tmol／1and41．0}tmol／

8、1，respectively．Theexperimentprovedthattheoptimumtemperatureof