基于吐温-姜黄素复合物的荧光探针检测脂肪酶活性.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第5期2015年5月ChineseJournalofAnalyticalChemistry658～662DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．140941基于吐温．姜黄素复合物的荧光探针检测脂肪酶活性汤燕张卫左焕桢刘佳江凌田丹碧(南京工业大学理学院，食品与轻工学院，南京211816)摘要本实验以姜黄素作为信号探针，吐温作为脂肪酶的底物和包裹姜黄素的载体，建立了一种检测脂肪酶活性的荧光法。实验发现，采用0．3mmol／L吐温40，25Ixmol／L姜黄素，并且脂肪酶水解吐温40的时间为35rain时，姜黄素的荧

2、光强度变化值与脂肪酶浓度在0．002—0．05mg／mL和0．05～0．25mg／mL范围内呈现线性关系，检出限为0．6mg／L(S／N=3)。此探针在高通量检测脂肪酶活性以及与脂肪酶相关疾病检测领域中有较好的应用前景。关键词姜黄素；吐温40；脂肪酶；荧光探针1引言许多疾病都与生物体内特定酶的活性密切相关，因此在生理条件下准确检测酶活性十分关键⋯．其中，脂肪酶(LipaseE．C．3．1．1．3)是作用于羧酸酯键的一类水解酶，与急性胰腺炎、肥胖症、动脉粥样化等疾病密切相关[2]。脂肪酶的催化机理与其它的水解酶并不相同，其催化水解反应发生在油．水界面上_3J，并且，它的底物为水不溶

3、性酯类化合物，在测定酶活性过程中，通常需要乳化，乳化剂的加入会显著影响酶活性检测的真实性_6，’]，所以建立一种可靠、简单、灵敏的检测脂肪酶活性的方法尤为重要。姜黄素是一种天然疏水性抗癌药物，其自身具有紫外和荧光性质'9]．可作为荧光信号探针；同时。吐温是一种两亲性的、生物相容性良好的非离子表面活性剂[1U1“]，它既作为脂肪酶的底物，又作为包封姜黄素的载体。因此，本研究利用姜黄素作为信号探针，吐温作为脂肪酶的底物和姜黄素的载体，构建了吐温．姜黄素复合物这一传感平台，用于脂肪酶活性的检测。与传统的滴定法、平板法和浊度法等相比，本方法无需乳化底物、操作简单、成本低廉，灵敏度得到明显

4、提高。2实验部分2．1仪器与试剂SpectraMaxM3微孑L板检测系统(美国分子仪器公司)，HH．S1恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)，电子天平(德国赛多利斯公司)。吐温20、40、60、80，姜黄素(Curcumin)，无水甲醇等均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。猪胰腺脂肪酶(PPL)和人血清购于北京索莱宝科技有限公司。除姜黄素是用无水甲醇配制以外，其余所有样品均在10mmol／L磷酸钠缓冲液(PBS，pH7．4)中制备得到。2．2脂肪酶的荧光检测分别移取1mL0．3mmol／L吐温40和10IxL2．5mmol／L姜黄素溶液于2mL离心管中，混匀，加入10L不同浓度的P

5、PL在37℃下反应35min后，在微孔板检测系统上测量体系加入PPL前后的荧光强度(图1)。最终，以一F(AF5∞)为纵坐标，PPL浓度为横坐标，绘制标准曲线，和F分别表示加入PPL前后的荧光强度。2．3实际样品测定将人血清在10000r／min下离心10rain，向所获得的上层清液中分别加入不同浓度的PPL溶液，配制成最终浓度分别为0．025，0．5和1．0mg／mLPPL的人血清样品，按照绘制标准曲线的方法进行检测2014．10-22收稿；2015-03-06接受本文系江苏省自然科学基金(No．BK2012822)、国家杰出青年科学基金(No．21225626)$E—mail

6、：danbi@njtech．edu．cn分析化学第43卷姜黄素加入到pH7．4的PBS缓冲溶液中时，反应1min，发现在425nm处出现一个低强度的吸收峰，并且在355nm处有个不明显的峰(图3b)；35min后，425Bill处的峰完全消失，355nm处有一个明显的吸收峰(图3a)，说明随着反应时间的不断延长，355rim处的峰越来越明显，其姜黄素与缓冲溶液相互作用越强。当吐温4O存在时，355rim处的峰完全消失。在425nm处出现一个高强度的吸收峰(图3d)；加入PPL后，同样355rim处的峰完全消失，但是在425nm处的吸收峰的强度要低于没有加酶的(图3c)，表明了吐温

7、40的存在能够显著降低姜黄素与缓冲溶液的相互作用，加入PPL后，会增强姜黄素与缓冲溶液的相互作用．导致姜黄素不断降解。这些现象再次验证此传感策略能很好Wavelength(nm)地用于检测脂肪酶活性。图3(a)磷酸钠缓冲溶液与姜黄素反应35min；3．2实验条件的优化(b)磷酸钠缓冲溶液和姜黄素反应1min；(C)吐温采用荧光光谱考察了吐温类型与浓度、姜黄素浓度40、姜黄素和PPL反应35min；(C)吐温4O与姜黄以及PPL水解吐温时间对此传感策略性能的影响。吐素反应35min