基于氢键诱导的纳米金比色传感器实时检测脂肪酶活性.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第4期2015年4月ChineseJournalofAnalyticalChemistry484～489DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．140890基于氢键诱导的纳米金比色传感器实时检测脂肪酶活性刘佳张卫汤燕江凌田丹碧胡娥(南京工业大学理学院，南京211816)(南京工业大学食品与轻工学院，南京211816)(材料化学工程国家重点实验室，南京工业大学，南京211816)摘要以巯基乙酸甲酯(MT)修饰的纳米金(AuNPs)为探针，构建了比色生物传感器检测脂肪酶活性。在pH6．5弱酸性条件下，脂

2、肪酶水解MT．AuNPs上的酯键生成带负电荷的羧酸根：在pH3．0的酸性条件下，探针间会产生强烈的氢键作用使AuNPs聚集，基于此可以检测脂肪酶活性。考察了温度、pH等因素对传感器响应信号的影响。MT．AuNPs溶液在650和520nm处的吸光度比值A／A与脂肪酶活性大小在3．0×10～4．5×10U／mL范围内呈现良好的线性关系，检出限为2．25×10。U／mL(S／N=3)。测定了5种商品化脂肪酶的活性，实验结果与恒电位滴定法测定结果一致，证明本方法具有良好的实用性。关键词脂肪酶；酶活性；纳米金；氢键；比色传感1引言脂肪酶(3．1．1．3)被认为是继蛋白酶、糖化酶

3、之后的又一重要工业用酶。工业用脂肪酶大多来源于微生物．筛选活力高、产量高及低成本的脂肪酶菌种是其关键技术环节，在脂肪酶的改造、分离、纯化以及重组蛋白的筛选等领域，脂肪酶活力的测定都是不可缺少的关键技术，因此，建立高通量的酶活性检测方法对于促进酶学研究和酶工程技术的发展都具有重要意义_】J。目前，脂肪酶活性检测普遍采用酸碱滴定法l5]、浊度法l6]及光度法_7]，但这些方法多存在灵敏度不高、误差大、且费时费力、不适用于高通量检测等不足。荧光法]虽然灵敏度较高，但大部分可被脂肪酶水解的荧光底物均受限于反应介质的酸度，另外荧光猝灭等因素还可能影响实验结果的精确性。对于动辄数

4、以千计的定向进化库而言，要进行高通量酶检测，这些方法存在较大局限性。因此迫切需要建立高灵敏度、高选择性，更加简单、快速、准确的脂肪酶检测方法。纳米金因其独特的表面等离子体共振(SPR)效应成为构建生物传感器的优良材料，已被用于多种酶分析研究中E8，尤其是基于纳米金的比色检测方法由于其简单、快速已成为高通量检测方法之一ll。本实验以巯基乙酸甲酯修饰的纳米金(MT—AuNPs)为比色探针，构建检测脂肪酶活性的生物传感器。在弱酸性磷酸缓冲溶液中，脂肪酶水解切割MT—AuNPs上的MT，生成羧酸根。通过调节溶液pH值至酸性，带有羧酸根残基的纳米金之间能够形成较强氢键，诱导Au

5、NPs聚集变色，基于此建立了氢键诱导纳米金比色传感方法检测脂肪酶的活性(如图1所示)。与传统方法相比，本方法具有快速、简单、价廉、灵敏度高等优势，可用于高通量、实时检测脂肪酶活性。2实验部分2．1仪器与试剂SpectraMaxM3微孔板检测系统(美国分子仪器公司)；JEM．200cx透射电子显微镜(日本电子株式会社)；B260恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)；电子天平(德国赛多利斯公司)；PHS-3CpH计(上海雷磁公司)；氯金酸、NaHPO、NaHPO、柠檬酸钠、柠檬酸、NaOH均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；巯基乙酸甲酯(MT，95％，百灵威科技有限公司)

6、；诺维信-435脂肪酶(Novozymes435，诺维信投资有限公司)；根霉脂肪酶(RNL，1．5U／mg)、猪胰脂肪酶(PPL)、洋葱假单胞脂肪酶(CRL)、2014-09-29收稿：2015-01-30接受本文系江苏省自然科学基金项目(No．BK2012822)、国家杰出青年科学基金(No．21225626)、国家高技术研究发展计划(No．2012AA021700)、国家自然科学基金(No．21106064)资助E—mail：danbi@njtech．edu．cn第4期刘佳等：基于氢键诱导的纳米金比色传感器实时检测脂肪酶活性489具有潜在的应用价值。Referen

7、ceslZhuYT，JiaYW，LiuYM，LiangJ，DingLS，LiaoX．Agric．FoodChem．，2014，62(44)：10679—106862NielsenAVF，AndficP，NielsenPM，PedersenLH．Langmuir．，2014，30(19)：5429—54343SahaK，AgastiSS，KimC，LiX，RotelloVM．Chem．Rev．，2012，112(5)：2739-27794YangG，WuJP，XuG，YangLR．Colloids．Surf．B．，2010，78(2)：351-3565