关键词重组人粒细胞集落刺激因子;反相高效液相色谱法;高效体积排阻色谱法;分子量;纯度

《关键词重组人粒细胞集落刺激因子;反相高效液相色谱法;高效体积排阻色谱法;分子量;纯度》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、目的：测定重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的蛋白浓度、分子量及纯度。方法：反相高效液相色谱(RP-HPLC)法及高效体积排阻色谱法(SEC)。结果：蛋白浓度测定方法可靠，平均回收率为100.17%，RSD=0.8%。重现性好，日内RSD=0.7%，日间RSD=1.1%，且与福林-酚法(Lowry法)测得结果无显著差异。样品无需处理，可直接上样，同时可得到样品的纯度数据。SEC法测得分子量与理论值相符合，且方法重现性好，日内RSD为0.7%，日间RSD为1.9%，在测定分子量的同时可得到rhG-CSF纯度数据。结论：适用于基因工程产品纯化各阶段以及

2、制剂蛋白浓度、分子量、纯度的测定。关键词　重组人粒细胞集落刺激因子；反相高效液相色谱法；高效体积排阻色谱法；分子量；纯度Analysisofrecombinanthumangranulocytecolonystimulatingfactorbyhigh-performanceliquidchromatographyZhongYing(HangzhouJiuyuanGeneEngineeringCo.Ltd,Hangzhou310018)ABSTRACT　OBJECTIVE：Todetermineproteincontent,proteinmolecular

3、weighandpurityofrecombinanthumangranulocytecolonystimulatingfactor(rhG-CSF).METHOD:Reversed-phasehigh-performanceliquidchromatography(RP-HPLC)andhigh-performacesize-exclusionchromatography(SEC)wereused.RESULTS:Themeanrecoveryis100.17%,RSD=0.8%.TheRSDofwithin-dayandday-todaywereles

4、sthan2.0%.Thesamplesdonotneedtobepretreated.CONCLUSION:Thismethodissuitabletoanalyzeproductsofgeneengineering.KEYWORDS　recombinanthumangranulocytecolonystimulatingfactor,RP-HPLC,SEC,molecularweigh,purity　　重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)是应用DNA重组技术生产的一种造血生长因子，它作用于骨髓中性粒细胞系造血前体细胞，促进其增殖、分化，促进中性粒

5、细胞的成熟和释放。临床上主要应用于肿瘤化疗引起的中性粒细胞减少症，用于外周干细胞动员，与抗生素合用预防或治疗感染等。　　rhG-CSF作为基因工程药物，在分离纯化过程中，蛋白质的定量测定对纯化的进行必不可少，同时在产品的质量控制中，蛋白质浓度也是一个极重要的指标［1］。蛋白质浓度的测定有多种方法，常用的方法有克氏定氮法、TCA比浊法、双缩脲法、福林-酚(Lowry)法、考马斯亮兰法(Bradford法)、紫外吸收法等等。但以上方法有种种局限性［2］，例如克氏定氮法方法过于繁琐，双缩脲法不够灵敏，有近200种化合物影响Lowry法测定的结果,Bradford

6、法在比色过程中易出现沉淀等等，因此以上方法均不适用于纯化过程中间体及成品中有干扰物存在时rhG-CSF蛋白的定量分析。我们通过实验选择反相高效液相色谱法(RP-HPLC法)作为测定有干扰因素存在时的蛋白定量，获得满意结果。　　同时rhG-CSF其分子量大小以及纯度均是一个重要指标。蛋白质分子量大小的测定有多种方法，常用的有十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法，聚丙烯酰胺梯度电泳，高效体积排阻色谱法(SEC法)［3］,比较先进的方法有质谱法［4］。SDS-PAGE法耗时长，且一块板上最多同时可分析8个样品。质谱法需要昂贵的设备，不易普及。

7、而高效体积排阻色谱法是根据溶质分子大小而分离的一种液相色谱技术，大分子优于小分子被洗脱出来，根据已知分子量的标准蛋白的洗脱体积可以建立测定蛋白质分子量的标准曲线，从标准曲线上计算出样品分子量。方法简便、快捷，一次可分析多个样品。我们通过实验选择高效体积排阻色谱法测定rhG-CSF分子量及纯度，获得满意结果。1　材料和仪器1.1　仪器　　Beckman公司高效液相色谱仪，包括125型泵，168型二极管阵列紫外检测器,SystemGold数据处理软件。色谱柱为Bio-sil250(7.8mm×300mm,Bio-Rad公司),VydacC4(150mm×4.6

8、mm)。1.2　试剂　　三氟醋酸(Merck公司)；乙腈(上海脑海