膀胱癌多药耐药的流式细胞术分析

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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果膀胱癌多药耐药的流式细胞术分析本实验旨在研究流式细胞术(flowcytometry,FCM)在膀胱癌细胞的多药耐药分析方面的作用，现报道如下。　　一、材料与方法　　1.试剂及仪器：DMEM、DNA提取试剂盒DNAzol、RNA提取试剂盒Trizol为Gibco产品；秋水仙素、甲酰胺、polybrene为Sigma产品；缺口平移系统(nicktranslation)为Promega产品，尼龙膜为ZetaProbe产品；鲑鱼精DNA购自晶

2、美生物公司；MDR-1pCR引物P1：5′CCCATCATTGCAATAGCAGC-3′,P2:5′-CTTCAAACTTCTGCTCC　　tGA-3′［1］，由军事医学科学院放射医学研究所合成；抗P-gp单克隆抗体JSB1购自福州迈新公司；FITC标记羊抗鼠IgG购自北京中山生物技术公司；阿霉素由法玛西亚公司福建办事处提供；FCM检测由北京中医研究院西苑医院流式细胞室完成。　　2.细胞株：转导人mdr-1课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和

3、理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果cDNA的逆转录病毒包装细胞PA317/PHamdr-1/A由本室保存［1］。人膀胱癌细胞株EJ由北京医科大学泌尿外科研究所提供。以上细胞均生长于DMEM培养基中，其中含体积分数为10%的胎牛血清和200mmol/L的L-谷氨酰胺，在体积分数为5%的CO2、37℃培养箱中培养。逆转录病毒转染EJ细胞参照文献［1］进行。　　3.转mdr-1基因细胞系EJ/MDR的鉴定：(1)PCR分析mdr-1基因的整合：参照DNAzoldNA提取说明书提取EJ/MDR-1细胞基因组DNA，取1μlD

4、NA用于PCR扩增。50μl体系：200μmol/LdNTPs、/LMg2+，2种引物各0.μmol/L，95℃预变性1min，加Taq酶U(Promega公司)。PCR仪上扩增：94℃变性4s，60℃退火4s，72℃延伸60s，30个循环后72℃延伸min，2%琼脂糖凝胶电泳检测16bp特异扩增带。(2)外源基因在转染细胞的表达分析：mdr-1基因cDNA探针用StuⅠ酶切质粒PHamdr-1/A获得，DIG缺口平移法标记探针，按Trizol说明书提取细胞总RNA，甲醛变性电泳检测RNA的质量，紫外吸收法定量，按文献［4］进行RNAdotblot。　　4.间接免疫

5、荧光分析：收集对数生长期EJ/Mdr-1及EJ细胞，PBS洗涤、离心2次。调节细胞浓度至×105个/ml,加入P-gp单抗JSB11mg/L,4℃放置30min；冷PBS洗2次，加入FITC标记羊抗鼠IgG，FCM检测P-gp蛋白表达；参照文献［3］行抗体稀释及细胞固定，4℃继续放置30课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果min；冷PBS洗2次后送检。　　测定

6、转基因细胞内阿霉素浓度：参照文献［3］进行。MTT法检测EJ/mdr-1细胞对化疗药物的体外敏感性：参照文献［4］进行。　　二、结果　　用PA317/PHamdr-1/A病毒上清转染的EJ细胞，秋水仙素(120μg/L)加压筛选3周，获得抗性克隆，命名为EJ/mdr-1，培养传代。提取EJ/mdr-1细胞DNA行PCR检测，可特异性扩增出16bp的mdr-1基因片段，而其亲代EJ细胞则未扩出此片段，从而证实有mdr-1基因的整合。提取已转导mdr-1基因的EJ细胞RNA，Dotblot结果证实EJ/mdr-1细胞中有mdr-1mRNA表达。mdr-1在EJ及EJ/m

7、dr-1的阳性表达率分别为(±)%和(±)%，差异有显著性(P＜)。EJ/mdr-1及EJ细胞内阿霉素荧光强度分别为±和±，差异有显著性(P＜)，MTT法检测发现，EJ/mdr-1细胞对阿霉素、秋水仙素的耐药倍数分别是其亲代EJ细胞的倍和倍，差异均有显著性(P＜)。 　　三、讨论课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果　　我们采用逆转录病毒介导将md