平面和三维培养对兔髓核细胞增殖和基质合成影响的实验研究_1

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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果平面和三维培养对兔髓核细胞增殖和基质合成影响的实验研究作者：朱磊，吴小涛，董寅生，王运涛，邱匀峰，张福勇，鲍军平【摘要】目的：探讨兔髓核细胞平面和三维培养对其增殖及基质合成的影响，为椎间盘组织工程寻找一种新的种子细胞获取方法。方法：体外培养兔髓核细胞，分为平面培养组和PLGA支架三维培养组两组，利用倒置显微镜、扫描电镜进行髓核细胞形态学观察，MTT法测定各组髓核细胞增殖情况，HE染色、免疫组化分析髓核细胞

2、Ⅱ型胶原的表达，阿利新兰染色法测定培养液中髓核细胞合成的糖胺聚糖含量。结果：经过两周的培养，两组髓核细胞均能够增殖；与平面培养组相比，三维培养组细胞增殖率、Ⅱ型胶原表达量、GAG合成量均增高。结论：髓核细胞能够与PLGA支架很好地黏附并增殖；PLGA支架三维培养较平面培养能促进髓核细胞增殖，提高Ⅱ型胶原和GAG的合成量，可作为椎间盘组织工程种子细胞获取的一种新方法。【关键词】椎间盘退变；髓核细胞；组织工程；PLGA支架；三维培养；兔椎间盘退变性疾病(intervertebraldiscdegenerationdisease，IDDD)是

3、一类具有高发病率及高致残率的骨科疾病。临床常用的保守治疗课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果和手术治疗方法不能从根本上逆转椎间盘细胞的退变，远期效果不佳。椎间盘组织工程学的迅速发展为IDDD提供了一种新的生物学治疗方法，其目的是通过逆转椎间盘细胞水平的病理改变，进而修复和重建退变的椎间盘组织。髓核细胞的退变在椎间盘退变中起了关键性

4、作用，因此，如何获得足量的具备正常生理功能的髓核细胞是椎间盘组织工程学要解决的核心问题。国外学者利用组织工程学方法，对髓核细胞的培养进行了大量的研究，但利用组织工程聚乳酸(PLA)/聚羟基乙酸(PGA)复合生物材料PLGA支架三维培养髓核细胞，国内外报道尚少。本实验通过探讨兔髓核细胞平面和PLGA支架三维培养对其增殖及基质合成的影响，为椎间盘组织工程寻找一种新的种子细胞获取方法。1材料与方法实验动物周龄新西兰大白兔10只，体重g，雌雄不拘。主要仪器、材料和试剂CO2孵箱，倒置相差显微镜，扫描电镜，PLGA支架，胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶，D-

5、Hank液，胎牛血清，DMEM/F12培养基、抗坏血酸、二甲亚砜(DMSO)、MTT、阿利新兰试剂、多聚赖氨酸，Ⅱ型胶原免疫组化一抗，多孔培养板。实验方法髓核细胞的分离获取和培养课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果取4周龄小乳兔，%戊巴比妥钠mg·kg-1肌肉注射处死，无菌条件下将胸腰段脊柱整段取出，尽量剥尽椎间盘前缘所附着的肌肉

6、，以D-Hank液冲洗2遍，尖刀切开椎间盘纤维环，用眼科镊将胶冻状椎间盘髓核完整取出，以DMEM/F12漂洗3遍后，吸取到%Ⅱ型胶原酶液中，3℃消化15～20min，期间用吸管轻轻吹打，待组织大部分消化、培养液浑浊后用200目不锈钢网过滤，悬液1000r·min-1离心min，混悬计数细胞，以1×105ml-1浓度接种到培养瓶中，生长培养液为DMEM/F12，置于3℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养。每天倒置显微镜观察细胞生长情况，d换液1次。另取部分原代培养的细胞爬片行Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定。PLGA支架材料的预处理和实验分组先将已

7、经制备好的PLGA支架材料用无菌手术刀片切割成周径10mm、高mm的圆柱体，以75%酒精浸泡30min，磷酸盐缓冲液反复冲洗后，培养箱内晾干，滴加适量多聚赖氨酸浸没支架材料，静置h，吸掉多余液体，完成包被，备用。将接近90%融合的原代髓核细胞弃去培养液，加入少量%胰蛋白酶消化细胞，倒置显微镜下观察，见细胞回缩、间隙增大时吸去消化液，加入适量含血清的培养液终止反应，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞，使之脱落形成细胞悬液。1000r·min-1离心min，弃上清，培养液漂洗2次后，用生长培养液DMEM/F12混悬细胞，计数制成1×10ml-1细胞悬液

8、。课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生