平面和三维培养对兔髓核细胞增殖和基质合成影响的实验研究论文

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1、平面和三维培养对兔髓核细胞增殖和基质合成影响的实验研究论文朱磊，吴小涛，董寅生，王运涛，邱匀峰，张福勇，鲍军平【摘要】目的：探讨兔髓核细胞平面和三维培养对其增殖及基质合成的影响，为椎间盘组织工程寻找一种新的种子细胞获取方法。方法：体外培养兔髓核细胞.freel公司），胎牛血清（杭州四季青公司），DMEM/F12培养基、抗坏血酸、二甲亚砜(DMSO)、MTT、阿利新兰试剂、多聚赖氨酸（PLL）（美国Sigma公司），Ⅱ型胶原免疫组化一抗（武汉博士德公司），多孔培养板（美国Corning公司）。1.3实验方法1.3

2、.1髓核细胞的分离获取和培养取4周龄小乳兔，0.5%戊巴比妥钠0.1mg·kg-1肌肉注射处死，无菌条件下将胸腰段脊柱整段取出，尽量剥尽椎间盘前缘所附着的肌肉，以D-Hank液（含青霉素100万U·L-1和链霉素1g·L-1）冲洗2遍，尖刀切开椎间盘纤维环，用眼科镊将胶冻状椎间盘髓核完整取出，以DMEM/F12（含青霉素10万U·L-1和链霉素0.1g·L-1）漂洗3遍后，吸取到0.25%Ⅱ型胶原酶液中，37℃消化15～20min，期间用吸管轻轻吹打，待组织大部分消化、培养液浑浊后用200目不锈钢网过滤，悬液1

3、000r·min-1离心8min，混悬计数细胞，以1×105ml-1浓度接种到培养瓶中，生长培养液为DMEM/F12（含15%优质胎牛血清、抗坏血酸30μg·ml-1、青霉素10万U·L-1、链霉素0.1g·L-1，pH7.0），置于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养。每天倒置显微镜观察细胞生长情况，2d换液1次。另取部分原代培养的细胞爬片行Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定。1.3.2PLGA支架材料的预处理和实验分组先将已经制备好的PLGA支架材料用无菌手术刀片切割成周径10mm、高3mm的圆柱体，以75%酒精浸

4、泡30min，磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗后，培养箱内晾干，滴加适量（2.5μg·ml-1）多聚赖氨酸（poly-l-lysine，PLL）浸没支架材料，静置4h，吸掉多余液体，完成包被，备用。将接近90%融合的原代髓核细胞弃去培养液，加入少量0.25%胰蛋白酶消化细胞，倒置显微镜下观察，见细胞回缩、间隙增大时吸去消化液，加入适量含血清的培养液终止反应，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞，使之脱落形成细胞悬液。1000r·min-1离心5min，弃上清，培养液漂洗2次后，用生长培养液DMEM/F12混悬细胞，计数制成1×

5、106ml-1细胞悬液。将制成的髓核细胞悬液分为平面培养组和PLGA支架三维培养组两组培养。1.3.3髓核细胞的形态学观察平面培养组：取2ml细胞悬液直接接种于6孔培养板中，共6孔，置于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养，2d换液1次，每日倒置显微镜观察并定期摄像。PLGA支架三维培养组：取包被后的PLGA支架8块，无菌条件下放置到两块6孔培养板中，每块支架材料内先滴加细胞悬液1ml，培养1h后翻转，再在另一面滴加1ml细胞悬液，置于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养，2d换液1次，每日倒置显微镜观察并

6、定期摄像。任选2块细胞支架复合物标本，在培养1周后弃掉培养液，PBS漂洗2遍后加适量4℃预冷3%戊二醛，4℃固定2h，PBS浸洗，10min×2次，梯度酒精脱水15min×2次。标本经乙腈置换、真空干燥、真空导电处理后进行扫描电镜观察摄像。1.3.4MTT法检测两组细胞增殖情况取24孔培养板两块，一板每孔直接接种浓度为1×106ml-1的细胞悬液1ml，共24孔，作为平面培养组；另一板每孔放入包被后的PLGA支架1块，将浓度为1×106ml-1的细胞悬液1ml接种到材料上，共24孔，作为PLGA支架三维培养组。

7、两组均为24孔，置于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养，2d换液1次，培养两周，于接种后第2、5、9、14天各组分别取6个复孔，每孔加入MTT（5mg·ml-1）100μl，37℃继续孵育4h，弃上清液，每孔加入DMSO1ml，振荡10min后，吸取各孔液体150μl于96孔培养板，酶标仪于490nm波长下检测各孔光密度值（OD值）。1.3.5HE染色、免疫组化分析两组髓核细胞Ⅱ型胶原的表达同1.3.3方法，将髓核细胞分为两组接种培养：两组各6孔，置于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中，2d换液1次，两组细

8、胞各培养两周。由于前面实验已经证实原代平面培养的细胞爬片Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性，主要着色部位是胞浆，细胞基质不表达Ⅱ型胶原，故将其中平面培养组髓核细胞在第10天时弃去培养液，加入少量0.25%胰蛋白酶消化细胞，倒置显微镜下观察，见细胞回缩、间隙增大时吸去消化液，加入适量含血清的培养液终止反应，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞，使之脱落形成细胞悬液。1000r·min-1离心5min，弃上清，