平面和三维培养对兔髓核细胞增殖和基质合成影响的实验研究

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1、平面和三维培养对兔髓核细胞增殖和基质合成影响的实验研究朱磊，吴小涛，董寅生，王运涛，邱匀峰，张福勇，鲍军平【摘要】目的：探讨兔髓核细胞平面和三维培养对其增殖及基质合成的影响，为椎间盘组织工程寻找一种新的种子细胞获取方法。方法：体外培养兔髓核细胞，分为平面培养组和PLGA支架三维培养组两组，利用倒置显微镜、扫描电镜进行髓核细胞形态学观察，MTT法测定各组髓核细胞增殖情况，HE染色、免疫组化分析髓核细胞Ⅱ型胶原的表达，阿利新兰染色法测定培养液中髓核细胞合成的糖胺聚糖（GAG）含量。结果：经过两周的培养，两组

2、髓核细胞均能够增殖；与平面培养组相比，三维培养组细胞增殖率、Ⅱ型胶原表达量、GAG合成量均增高（均P0.01）。结论：髓核细胞能够与PLGA支架很好地黏附并增殖；PLGA支架三维培养较平面培养能促进髓核细胞增殖，提高Ⅱ型胶原和GAG的合成量，可作为椎间盘组织工程种子细胞获取的一种新方法。【关键词】椎间盘退变；髓核细胞；组织工程；PLGA支架；三维培养；兔椎间盘退变性疾病(intervertebraldiscdegenerationdisease，IDDD)是一类具有高发病率及高致残率的骨科疾病。临床常用

3、的保守治疗和手术治疗方法不能从根本上逆转椎间盘细胞的退变，远期效果不佳。椎间盘组织工程学的迅速发展为IDDD提供了一种新的生物学治疗方法，其目的是通过逆转椎间盘细胞水平的病理改变，进而修复和重建退变的椎间盘组织。髓核细胞的退变在椎间盘退变中起了关键性作用，因此，如何获得足量的具备正常生理功能的髓核细胞是椎间盘组织工程学要解决的核心问题。国外学者利用组织工程学方法，对髓核细胞的培养进行了大量的研究，但利用组织工程聚乳酸(PLA)/聚羟基乙酸(PGA)复合生物材料PLGA支架三维培养髓核细胞，国内外报道尚少

4、。本实验通过探讨兔髓核细胞平面和PLGA支架三维培养对其增殖及基质合成的影响，为椎间盘组织工程寻找一种新的种子细胞获取方法。1材料与方法1.1实验动物4周龄新西兰大白兔（东南大学实验动物中心提供）10只，体重（500±30）g，雌雄不拘。1.2主要仪器、材料和试剂CO2孵箱（德国Heraeus公司），倒置相差显微镜（德国Zeiss公司），扫描电镜（日立H-7650型），PLGA支架（东南大学材料科学与工程学院提供），胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶（美国Gibco公司），D-Hank液（德国Biochrom公司），

5、胎牛血清（杭州四季青公司），DMEM/F12培养基、抗坏血酸、二甲亚砜(DMSO)、MTT、阿利新兰试剂、多聚赖氨酸（PLL）（美国Sigma公司），Ⅱ型胶原免疫组化一抗（武汉博士德公司），多孔培养板（美国Corning公司）。1.3实验方法1.3.1髓核细胞的分离获取和培养取4周龄小乳兔，0.5%戊巴比妥钠0.1mg·kg-1肌肉注射处死，无菌条件下将胸腰段脊柱整段取出，尽量剥尽椎间盘前缘所附着的肌肉，以D-Hank液（含青霉素100万U·L-1和链霉素1g·L-1）冲洗2遍，尖刀切开椎间盘纤维环，用

6、眼科镊将胶冻状椎间盘髓核完整取出，以DMEM/F12（含青霉素10万U·L-1和链霉素0.1g·L-1）漂洗3遍后，吸取到0.25%Ⅱ型胶原酶液中，37℃消化15～20min，期间用吸管轻轻吹打，待组织大部分消化、培养液浑浊后用200目不锈钢网过滤，悬液1000r·min-1离心8min，混悬计数细胞，以1×105ml-1浓度接种到培养瓶中，生长培养液为DMEM/F12（含15%优质胎牛血清、抗坏血酸30μg·ml-1、青霉素10万U·L-1、链霉素0.1g·L-1，pH7.0），置于37℃、饱和湿度、

7、5%CO2孵箱中培养。每天倒置显微镜观察细胞生长情况，2d换液1次。另取部分原代培养的细胞爬片行Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定。1.3.2PLGA支架材料的预处理和实验分组先将已经制备好的PLGA支架材料用无菌手术刀片切割成周径10mm、高3mm的圆柱体，以75%酒精浸泡30min，磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗后，培养箱内晾干，滴加适量（2.5μg·ml-1）多聚赖氨酸（poly-l-lysine，PLL）浸没支架材料，静置4h，吸掉多余液体，完成包被，备用。将接近90%融合的原代髓核细胞弃去培养液，加入少

8、量0.25%胰蛋白酶消化细胞，倒置显微镜下观察，见细胞回缩、间隙增大时吸去消化液，加入适量含血清的培养液终止反应，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞，使之脱落形成细胞悬液。1000r·min-1离心5min，弃上清，培养液漂洗2次后，用生长培养液DMEM/F12混悬细胞，计数制成1×106ml-1细胞悬液。将制成的髓核细胞悬液分为平面培养组和PLGA支架三维培养组两组培养。1.3.3髓核细胞的形态学观察平面培养组：取2ml细胞悬液直接接种于6孔培养板中