羊胎素对体外骨髓基质细胞的增殖和向成骨细胞分化的影响论文

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1、羊胎素对体外骨髓基质细胞的增殖和向成骨细胞分化的影响论文艾春媚，魏泉德，吴怡，崔燎【关键词】羊胎素；,,骨髓基质细胞；,,成骨细胞；,,增殖；,,分化摘要：目的探讨羊胎素对体外培养的SD大鼠骨髓基质细胞(MarroaCells,MSCs)的影响。方法用MTT法检测MSCs的增殖；PNPP偶氮法检测MSCs碱性磷酸酶（ALP）的活性；细胞ALP染色观察成骨细胞的形成。结果在含羊胎素原液的0.625%，1.25%，2.5%和5%时对体外培养的SD大鼠MSCs有明显的促进增殖的作用（P0.01）;在含羊胎

2、素原液的2.5%及5%+成骨诱导剂时，ALP的活性明显高于诱导剂对照组（P0.05），而在含羊胎素原液的2.5%和5%浓度组.freellambplacenta,onSDrat'smarroacells(MSCs)proliferationandosteogenicdifferentiationinvitro.MethodsProliferationofMSCsmediatedbylambplacentineasuredbyMTTassay.Thealkalinephosphatase(ALP)ac

3、tivityofMSCsinedbyALPstaining.ResultsThegrobplacentinattheconcentrationof0.625%,.freelbPlacentinbplacentincanremarkablyincreasetheproliferationandinducetheosteogenicdifferentiationofMSCs.Keybplacentin;Marroacells;Osteoblasts;Proliferation;Differentiati

4、on羊胎素是利用现代生物技术从羊胎中提取的一种纯天然的生物活性物质，含有丰富的蛋白质，具有明显的抗辐射、抗衰老、抗肿瘤及提高人体免疫能力的作用［1~3］。本实验利用蛋白酶水解提取之羊胎素作用于体外培养的SD大鼠MSCs，观察羊胎素对MSCs增殖及向成骨细胞分化的影响，为羊胎素作为预防和治疗骨质疏松症提供依据。1器材1.1试剂与仪器DMEM（H、L糖）培养基，Gibco公司产品；胎牛血清，杭州四季清公司产品；胰蛋白酶、噻唑蓝、对硝基苯磷酸二钠、维生素C、地塞米松和β-甘油磷酸钠均为Sigma公司产品；

5、Percoll液，Amershampharmacia公司产品；DMSO，江苏如皋富康试剂厂产品；其它试剂为广州化学试剂厂产品；CO2培养箱（美国NAPCO）；酶标仪（美国ELX800）；离心机（上海安亭仪器厂）。1.2药物羊胎素（即羊胎水解液）由本院医药科技开发中心提供，取来自内蒙的健康羊胎，用现代工艺低温冷冻干燥制成。实验时取羊胎粉300mg，在10倍量水中用蛋白酶水解8h，除去杂质，灭菌，得澄清透明的羊胎水解液（总氮含量N=0.69%,pH值6.5）；实验时以原液为100%含量，用三蒸水稀释，实

6、验终浓度为含原液的0.625%，1.25%，2.5%，5%和10%5个浓度组。1.3动物1月龄SD大鼠，雌雄各半。由本院动物中心提供(实验动物合格证：粤监证字2005A023号；发证机关：广东省实验动物监测所。动物实验环境设施监测合格证：粤监证字2005C055号；发证机关：广东省实验动物监测所)。2方法2.1细胞培养参照文献［4］，用Percoll液进行密度梯度离心的方法和传代贴壁筛选的方法相结合，分离培养大鼠MSCs。脱颈处死SD大鼠，用75%酒精浸泡5min，在无菌条件下分离大鼠两侧股骨，去除

7、软组织，切除股骨两端，每根股骨用5mlDMEM(L)培养液从股骨上端往下冲出骨髓，将每根冲出的骨髓收集于同一烧杯中，充分吹散细胞，900r/min离心10min，弃上清液。沉淀用DMEM(L)培养液3ml制成细胞悬液，将细胞悬液加到等体积的密度为1.073g/ml的Percoll分离液上，900r/min离心30min后，收集界面层细胞，用DMEM(L)培养液洗涤离心2次，最后用含10%胎牛血清DMEM（L）培养液（含100U/ml青霉素100μg/ml链霉素）重悬，吹打均匀后以4×105/cm2密

8、度接种到25cm2培养瓶中，置37℃，5%CO2饱和湿度培养箱培养。7d后首次换液，去除悬浮细胞，以后每3天换液1次，细胞融合后用0.25%胰蛋白酶消化，传代。本实验用传至3~4代的MSCs进行实验。2.2MSCs增殖率测定0.25%胰蛋白酶消化已融合成片的基质细胞，并吹打成单细胞悬液，以5×104个/ml接种于96孔塑料培养板，100μl/孔，24h后将培养液换成含5%胎牛血清的DMEM（L）培养基90μl/孔，同时加入各浓度的羊胎素10μl/孔，使其终浓度为0.6