巴戟天对骨髓基质细胞向成骨细胞分化影响的实验研究

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1、福建中医学院学报2004年6月第14卷第3期16JournalofFujianCollegeofTCMJune2004914(3.实验研究.巴戟天对骨髓基质细胞向成骨细胞分化影响的实验研究王和鸣9王力9李楠(福建中医学院骨伤系9福建福州350003摘要:为探讨巴戟天对骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响9采用含药血清的方法体外培养骨髓基质细胞9分A组(巴戟天水提物组~B组(巴戟天醇提物组~C组(对照组~D组(经典成骨诱导组~E组(巴戟天水提物+经典成骨诱导组~F组(巴戟天醇提物+经典成骨诱导组9观察各组碱性磷酸酶染色~茜素红染色~碱性磷酸酶比活性及骨钙素含量9

2、结果显示碱性磷酸酶染色和茜素红染色反应强弱的顺序为F组>E组>D组>B组>A组9C组为阴性9碱性磷酸酶比活性和骨钙素(BGP含量测定结果为:A~B~D~E~F组在同一时间点均高于C组(P<0.059E组~F组在同一时间点均高于D组(P<0.05,说明巴戟天水提物及醇提物均能促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化9且巴戟天醇提物的作用强于水提物,关键词:巴戟天9大鼠模型9骨髓基质细胞9成骨细胞9分化9影响中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号:10045627(200403001605骨髓基质细胞(bonemarrowStromalcellS9(中国原子能科

3、学研究所等,BMSCS具有多向分化潜能9它在不同的诱导条2巴戟天水提物~巴戟天醇提物的制备件下9能向成骨细胞~成软骨细胞~成纤维细胞~脂2.1巴戟天水提取物的制备:巴戟天产地福建9肪细胞等中胚层组织细胞分化[1],近年来研究表500g粉碎后加双蒸水8倍9浸泡2h9煮沸1h9明9体外可以诱导BMSCS分化为成骨细胞[2]9在收集药液9再加双蒸水6倍9煮沸1h9收集药液9常用的诱导方法中9多选择地塞米松~维生素C再加双蒸水9煮沸1h9合并3次药液9以3000r/和B甘油磷酸钠作为主要诱导剂9为研究中医药min离心30min9取上清液94冰箱保存,在BMSCS成

4、骨诱导分化中的作用9我们选用中2.2巴戟天醇提取物的制备:巴戟天500g粉药巴戟天作为研究对象9采用中药血清药理学的碎9以95%乙醇回流提取3次9每次1h9回收乙方法体外培养BMSCS9观察其不同活性部位的巴醇至尽9浸膏备用94冰箱保存,戟天对骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响,2.3含巴戟天水提物~巴戟天醇提物血清的制备:给SD大鼠灌胃的剂量相当于临床等效剂量9实验材料(根据人和动物体表面积折算的等效剂量比率1仪器与试剂:倒置相差显微镜(日本OLYM表'计算,每日剂量分2次口服9连续给药3d9第PUS9CO2培养箱(德国~eraeuS9DU650紫外4d1

5、次服用全天剂量9采血前禁食12h9末次给分光光度计(美国BECKMAN9MEM(~y药1h后采血,以3000r/min离心15min9分离Clone9新生牛血清(NCS9~yClone9青链霉素血清956水浴930min灭活920冰箱保存备溶液(~yClone9~EPES(上海生工9胰蛋白酶(1用,=2509AMRESCO9B甘油磷酸钠(BGP9实验方法Sigma9地塞米松(Sigma9VitC(上海化学试剂公司9碱性磷酸酶(ALP和总蛋白试剂盒(南京1大鼠MSC的分离与培养:取30d龄SD大鼠建成生物工程研究所9骨钙素(BGP放免试剂盒的股骨和胫骨9去除

6、附着的软组织9切去骺软骨9收稿日期:20040315基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30271630作者简介:王和鸣(19439男9教授9主要从事骨折愈合研究,第3期王和鸣等;巴戟天对骨髓基质细胞向成骨细胞分化影响的实验研究17暴露髓腔,注射器吸取含15%NCS的O-MEM培3.2茜素红染色法;各组诱导至第21d时,吸去养液反复冲洗,冲洗液移入离心管,1OOOr/min成骨细胞诱导液,PBS洗3次,95%酒精固定1O离心5min,沉淀用15%NCS的O-MEM培养液min,加入O.1%茜素红-TriS-Hcl(pH8.3)37C,反复吹打制成细胞

7、悬液,细胞计数板计数有核细3Omin,镜下观察结果O胞数,调整有核细胞数为2>1O5/ml,接种于25O3.3碱性磷酸酶比活性的测定;每组各设3孔,ml培养瓶中,置37C~5%CO2~95%空气的二氧各组分别诱导至第1~3~6~9~12d进行碱性磷酸化碳培养箱中培养O接种72h后半量换液,以后酶比活性的测定O测定时取培养液,分别按碱性磷每2~3d换液1次,至15d细胞会合成单层,用酸酶和总蛋白试剂盒说明书进行操作,碱性磷酸O.25%胰蛋白酶消化,按1=3的比例进行传代接酶比活性计算;碱性磷酸酶比活性(U/mg)=碱种培养,并标记为F1,传代培养过程中每2~

8、3d性磷酸酶活性(U/L)+蛋白浓度(mg/L)O换液1次,直至细