大肠杆菌检查实验报告

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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划大肠杆菌检查实验报告　　实验三Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白　　一、实验目的利用WesternBlotting技术，定性检测苦荞黄酮醇合酶基因在大肠杆菌表达宿主菌EscherichiacoliBL(DE3)中的诱导表达。　　二、实验原理　　黄酮醇合酶属于2-ODD家族，催化黄酮醇合成支路中最后一步氧化反应，也是直接合成黄酮醇的反应。FLS　　可以使二氢黄酮醇在C3链中C2

2、和C3之间氧化形成双键，从而生成黄酮醇：aDihydroflavonol+2-oxoglutarate+O2aFlavonol+succinate+CO2+H2O。　　本实验采用PCR的方法，在苦荞黄酮醇合酶基因ORF起始密码子前引入Kpn?酶切位点，去掉终止密码并引入BamH?酶切位点。克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中，其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6×His标签。重组质粒经鉴定后转化表达宿主菌E.coliBL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。收集

3、诱导0h、2h、4h、6h和8h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Westernblotting分析。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　Westernblotting的标准流程如下：蛋白质首先通过SDS-PAGE胺凝胶电泳分离，通过电泳转移到固相支持物上；将膜上未反应的位点

4、封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。　　本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体与重组FtFLS蛋白的N-末端和C-末端6×His发生抗原-抗体特异反应，再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG与一抗发生特异结合，最后使用DAB进行显色。DAB即：二氨基联苯胺，是过氧化物酶的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，

5、在免疫组化，原位杂交，Westernblotting等膜显色中　　应用广泛。　　三、操作步骤　　样品的制备　　原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测大肠杆菌重组蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。　　材料与试剂：　　重组pET-30b(+)-FtFLS质粒、表达宿主菌E.coliBL21(DE3)、LB固体培养基、LB液体培养基、Kan、IPTG、PBS缓冲液、5XSDS上样缓冲液。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的

6、发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　仪器与设备：　　恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、酒精灯、消毒酒精、棉球、接种环、台式离心机、冰盘、Tip、微量加样器、离心管。　　操作步骤：　　①含重组质粒pET-30b(+)-FtFLS的表达宿主菌E.coliBL21(DE3)划线于LB固体培养基，37℃培养16h。　　②挑选单菌落，接种至10mLLB培养基于37℃过夜

7、培养，即为种子液。　　③按2%的接种量将种子液接种到50mLLBKan培养基中，于37℃培养OD600至。　　④加入IPTG至终浓度为1mmol/L，置于25℃连续诱导表达8h，分别取诱导前0h，诱导后2h、4h、6h和8h的培养液5mL于10mL离心管中，置于冰水混合物上备用。　　⑤诱导完毕后，各样品于8000rpm离心5min收集沉淀，用等体积PBS重悬漂洗细胞2次，收集菌体。　　⑥各管分别加入400μLPBS重悬细胞，加入100μL5XSDS上样缓冲液，置于沸水浴中10min。　　注意事项：　　

8、①重组蛋白(转载于:写论文网:大肠杆菌检查实验报告)的诱导表达应进行正确的无菌操作并加入适宜浓度的抗生素，避免可能的污染。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　②在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性。　　③选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共