抑制剂对多酚氧化酶的抑制作用

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1、番茄中番茄红素和β－胡萝卜素的提取及含量测定巴沁乐陈晟陈凯杰（浙江大学农业与生物技术学院，浙江310058）摘要：多酚氧化酶（PPO）普遍存在于植物组织中，组织被匀浆或损伤后，即被活化并催化组织中的多酚氧化产生褐变，给水果加工带来影响。番茄红素是主要存在于番茄、葡萄柚等植物果实中一种类胡萝卜素,是目前自然界中被发现的最强抗氧化剂。分别以邻苯二酚、苯酚、Tricine做底物，在393nm处每隔10s测定吸光度值变化，发现土豆中PPO对邻苯二酚有较强催化活性，而对后两者的催化活性很弱。以邻苯二酚额为底物，在反应液中加入番茄红素，一定程度上抑制了土豆多酚氧化酶活性。关键词：多酚

2、氧化酶；邻苯二酚；抗氧化；番茄红素多酚氧化酶（PPO）普遍存在于高等植物组织中，当组织被匀浆或损伤后，PPO即被活化，催化多酚氧化为醌，醌聚合并与细胞内蛋白质中的氨基酸残基反应，结果产生黑色素沉淀（褐变），给水果加工和生产带来影响，故寻找一种合适的抗氧化剂十分必要。番茄红素是一种脂肪烃，属于类胡萝卜素的一种，在分子结构上有11个共轭双键和2个非共轭双键，因此强抗氧化性，有文献报道，其抗氧化能力为维生素E的1000倍，并具有增强免疫、清除自由基、防治多种癌症等重要的生理功能，成为近年来的研究热点之一。虽然其纯品价格昂贵，但其超强的抗氧化能力使其能以极少用量即能达到理想的抗氧

3、化效果，因此具有作为抗褐变剂被运用于食品生产的潜力。本文阐述了将从新鲜番茄中提取的番茄红素用于抑制土豆多酚氧化酶活性的探究，并对土豆多酚氧化酶底物专一性做了初步研究。1实验部分1.1仪器与设备电子天平；圆底烧瓶；量筒；回流冷凝管；加热套；抽滤装置；分液漏斗；三角漏斗；纱布；锥形瓶（具塞）；层析柱；胶头滴管；紫外分光光度计。1.2材料与试剂新鲜番茄；95%乙醇（AR）；二氯甲烷（AR）；氯仿（CP）；石油醚（AR）；苯（AR）;饱和氯化钠溶液（AR）；中性氧化铝（AR）；无水硫酸钠（AR）；无水硫酸铵（AR）;Tris-HCl缓冲液；Tween-80（AR）;甘油(AR)；

4、苯酚（AR）;邻苯二酚（AR）;Tricine(AR)。1.3实验步骤1.3.1番茄红素和β－胡萝卜素提取和分离1.3.1.1混合色素的提取称取新鲜番茄10g于100mL圆底烧瓶中，加95％乙醇40mL，摇匀，装上回流冷凝管，控制温度不超过90度加热回流15min，趁热将溶液倾出，残渣留在瓶内，加入30mL二氯甲烷，加热回流15min（控制温度不超过九十度），冷却，将上层溶液倾出抽滤，固体仍保留在烧瓶内，再加10mL二氯甲烷重复萃取一次。合并乙醇和2次二氯甲烷提取液，倒入分液漏斗中，加5mL饱和氯化钠溶液，振摇，静止分层。分出橙黄色有机相，使其流经一个在颈部塞有纱布且在纱

5、布上铺一层2cm厚的无水硫酸钠的三角漏斗，流入10ml圆底烧瓶，以除去微量水分。由于所得类胡萝卜素量较少，再称取新鲜番茄20克重复上述操作，并将两次得到的溶液合并。层析之前，将此溶液在通风橱中用热水浴蒸发至干。1.3.1.2层析柱的制备取一支干燥的层析柱（底部有砂芯层），将其垂直固定于铁架上。加入3ml石油醚检验其下滴速度（全速条件下，以检验砂芯层是否被堵塞），选择一支滴速正常的层析柱。关闭活塞，将氧化铝加入石油醚中，用滴管吸取石油醚和氧化铝，慢慢加入柱内，直至氧化铝最上沿离柱顶1.5cm左右，打开活塞使溶剂缓缓下滴，待溶剂液面下降至刚好与氧化铝表面相切时，关闭活塞，备用

6、。1.3.1.3柱层析分离将粗制的类胡萝卜素溶解于1ml左右的苯中，用滴管在氧化铝表面附近沿柱壁缓缓加入柱中，打开活塞，至有色物料在柱顶刚流干时即关闭活塞。用滴管取几毫升石油醚，沿柱壁洗下色素，并通过放出溶剂至柱顶流干，从而使色素吸附在柱上。然后加大量的石油醚洗脱，黄色的β－胡萝卜素在柱中移动较快，红色的番茄红素移动较慢。收集洗脱液至黄色的β－胡萝卜素从柱上完全除去，然后用极性较大的氯仿作洗脱剂洗脱番茄红素。将收集到的番茄红素在通风橱内用热水蒸发至干。1.3.2土豆中多酚氧化酶(PPO)的提取和纯化1.3.2.1粗酶液的获得取15g马铃薯，加入50mL缓冲液为50mMpH

7、7.0Tris-HCl（-20°C预冷）加石英砂研磨15min。离心7500r/min20min取上清液，即为PPO的粗酶液。1.3.2.2硫酸铵分级沉淀在PPO的粗溶液中加入16.5g硫酸铵使其饱和度达到30%左右进行沉淀，然后再高速离心机中4℃，7500r/min，4°C离心15min，弃去上清。用Tric-HCl缓冲溶液溶解沉淀，根据溶液体积加入12g硫酸铵，使其饱和度达到50%左右进行沉淀，7500r/min，4°C离心15min，弃去上清。用Tric-HCl缓冲溶液溶解沉淀，根据溶液体积加入19.5g硫酸铵，使其饱和