达托霉素的HPLC的方法学研究.doc

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1、摘要建立达托霉素含量和有关物质的测定方法。方法以达托霉素和一些杂质为对照品，采用高效液相色谱法进行测定。色谱条件为色谱柱：PhenomenexIB-SILC84.6×250mm5µm，流速：1.0ml/min，检测波长：223nm，进样量：25µl，柱温：25℃，梯度洗脱的流动相A：称取3.4g磷酸二氢铵用1000ml注射用水溶解，用磷酸调pH至3.1，流动相B：乙腈。结果使达托霉素的线性、精密度、准确度等达到了要求。[关键词]含量,有关物质,线性,精密度,准确度,耐用性目录摘要3一、仪器与药品

2、5二、方法建立与方法描述5(一)、方法建立5（二）、方法描述5三、验证内容7（一）系统适应性7（二）降解实验8（三）专属性8（四）定量限LOQ和检测限LOD9（五）线性12（六）相对校正因子的计算18（七）精密度18（八）准确度23（九）溶液稳定性26（十）耐用性28四、结论29五、典型图谱30六、参考文献30一、仪器与药品电子分析天平XP205已校正高效液相色谱仪Agilent1200已校正磷酸二氢铵分析纯上海光铧科技有限公司20121215乙腈色谱纯MerckUN1648注射用水每日更新本厂

3、自制纯化水每日更新本厂自制达托霉素对照品P1301，94.7%本实验室内部标定水解物P1301，91.4%本实验室内部标定β-异构体P1301，71.9%本实验室内部标定脱水物P1301，86.6%本实验室内部标定达托霉素样品S130301浙江海正药业股份有限公司生产二、方法建立与方法描述（一）、方法建立袁干军等曾报道达托霉素及A21978C组分的含量中提到色谱条件为色谱柱ShimadzuVP-ODS(250×4.6mm,5.0μm);梯度洗脱的流动相A:乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液(

4、30:70),流动相B:乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液(70:30);流速1.0mL/min;检测波长为223nm,260nm,280nm,360nm。由于达托霉素的成品用上述方法使一些杂质分离的效果不是很理想，因此，把磷酸二氢铵缓冲盐的PH值调整为3.1，梯度也有相应的调整，检测波长使通过二极管阵列检测器(DAD)检测，在190nm～360nm区间进行DAD全波段扫描。通过DAD扫描结果显示样品在223nm附近具有最大吸收，综合考虑确定223nm为高效液相色谱仪检测波长。由于达托霉素的

5、分子量比较大以及杂质与主峰分离效果综合考虑最终采用PhenomenexIB-SILC84.6×250mm5µm色谱柱。（二）、方法描述[含量]色谱柱：PhenomenexIB-SILC84.6×250mm5µm流速：1.0ml/min检测波长：223nm进样量：25µl柱温：25℃进样器温度：2~8℃流动相A：称取3.4g磷酸二氢铵用1000ml注射用水溶解，用磷酸调节pH至3.1流动相B：乙腈流动相：梯度洗脱A(%)B(%)067.532.54560405050505550505667.532

6、.56067.532.5稀释剂：注射用水标准溶液：精密称取达托霉素对照品25mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。样品溶液：精密称取达托霉素样品25mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。系统适应性：连续注射5针标准溶液，计算峰面积RSD不大于2.0%。用下式计算达托霉素中C72H101N17O26的含量：湿计含量%=ru×Cs×P×100%rsCu式中：Cu，Cs分别是样品溶液与标准溶液的配制浓度（mg/ml）rs是标准溶液所对应的主峰峰面积ru为样品溶液所对应的主峰峰面

7、积P为对照品的含量，%无水无残溶含量计算公式：干计含量%=湿计含量%1-水分%-残溶%限度：以无水无溶剂计算，达托霉素中C72H101N17O26含量应≥93.0%。[有关物质]色谱条件和样品溶液同含量。1%对照溶液：精密移取含量项下标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。用下式计算各已知杂质、单个杂质和总杂质的含量：含量%=ru×Cs×P×100%rsCu式中：Cu，Cs分别是样品溶液与1.0%对照溶液的配制浓度（mg/ml）rs是1.0%对照溶液所对应的主峰响应值ru为样

8、品溶液中各杂质对应的峰响应值P为对照品的含量，%限度：脱水达托霉素≤1.5%，β异构体杂质≤0.7%，水解物≤0.4%，杂质1（RRT约为0.79）≤0.2%，杂质2（RRT约为0.92）≤0.2%，杂质3（RRT约为0.94）(C9)≤0.6%，杂质4（RRT约为0.96）≤0.5%，杂质5（RRT约为1.07）（C11）≤0.7%，杂质6组（RRT约为1.20～1.25）≤0.6%单个未知杂质≤0.1%，总杂质≤5.0%三、验证内容（一）、系统适应性系统适应性溶液：精密称取达托霉素对照品P1