双羟维生素d3对实验性自身免疫性脊髓炎小鼠自噬的调控作

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权归河北医科大学所有。否则，承担相应法律责任。研究生签名：嘲超导师签名：西∥二级学院领导签章：‘t>。恕年弓月右旧河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注

2、和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。’'．_■o●研究生签名：谚勃韶导师签章：1即力Ⅻ瞄年≥月汀日1万方数据目录中文摘要1英文摘要4英文缩写8研究论文1，25一双羟维生素D3对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠自噬的调控作用前言日U舌9材料与方法1O结果19附图22讨论26结论29参考文献29综述维生素D、自噬与疾病33致谢42个人简历43万方数据中文摘要1，25．双羟维生素D3对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠自噬的调控作用摘要目的：多发性硬化不仅是中枢神经系统

3、的自身免疫性疾病，也是一种神经变性疾病，其发病率和地理纬度具有明显相关性，越远离赤道，多发性硬化的发病率越高。本实验选用1,25(OH)12D3作为干预药物，研究其治疗多发性硬化的有效性，不仅研究其对中枢神经系统白质髓鞘的影响，还深入研究对灰质神经元的作用，并进一步探索其潜在的作用机制。方法：将27只周龄在8—10周左右，体重在18-209左右的C57BL／6雌性小鼠随机分为正常对照组，EAE组，VD3组(即1，25(OH)2D3给药组)，各组均为9只。以MOG多肽为抗原免疫后两组小鼠建立EAE动物模型。以25099人工合成MOG

4、35．55多肽溶到500p,1生理盐水中，和等体积含lmg／ml结核菌素的完全福氏佐i}IJ(CFA)混合，加入结核杆菌H37Ra使结核菌素补充至400ng，充分混匀至油包水乳剂，制成完全抗原，双侧背部分4点皮下注射。于免疫后的第0和48h两次给予小鼠腹腔内注射500ng的百日咳毒素，以建立小鼠的EAE模型。免疫当天记为0天。VD3组小鼠自免疫当天起每隔两日腹腔注射0．1ml1,25(OH)2D3(用洁净蓖麻油稀释至浓度为1ug／m1)，空白对照组和EAE组小鼠均同天腹腔注射O．1ml蓖麻油，直至处死。从免疫当天开始，每天早晚(8

5、：oo和16：oo)两次由两位观察者分别对各组小鼠进行神经功能的评分、称重并给予记录。于免疫后第20天，对三组小鼠进行取材。断颈处死小鼠后，对小鼠大脑组织新鲜取材，切分成两部分，前三分之一，后三分之二(此部分以下称为侧脑室旁脑组织)，一部分迅速投入液氮进行快速冷冻，后置于一80℃冰箱保存，进行WesternBlot检测自噬相关蛋白Beclinl和LC3的表达情况；对脊髓腰骶膨大组织新鲜取材后置于4％多聚甲醛保存，部分制成石蜡切片，进行HE、LFB、Nissl染色，观察炎性细胞的浸润、脱髓鞘情况及神经元形态数目变化；剩余部分的侧脑室

6、旁脑组织和腰骶膨大组织则制成冰冻切片，进行免疫荧光法检测，分别单染NeuN观察神经元的变化，双染NeuN和Beclinl，万方数据中文摘要NeuN和LC3，观察神经元自噬水平的变化。数值采用“均数±标准差”表示，EAE发病率应用Fisher’S确切概率法，临床评分应用Mann—WhitneyU检验。两组间炎性浸润及脱髓鞘对比应用t检验。多组间的计量资料均数比较应用One—WayANOVA检验，两两比较应用SNK．曰检验或Dunnett’S检验。P

7、白对照组(Control组)小鼠均未发病，活动、食欲等方面均正常。EAE组小鼠发病率达100％，自免疫第一天即出现不同幅度的体重下降，之后逐渐出现活动减少、尾巴无力、反应不灵敏和皮毛不光滑等症状。1，25(OH)2D3治疗组(VD3组)小鼠至取材发病率仅为11．1％(尸<0．01)。通过比较后两组中小鼠每天的神经功能评分的均数发现，自第11天开始，VD3组小鼠的神经功能评分显著地低于EAE组小鼠(第11天，P<0．05；之后P<0．01)。21，25(OH)2D3明显减轻EAE小鼠脊髓炎性细胞的浸润及髓鞘脱失2．1小鼠腰骶膨大组织

8、HE染色示：Control组小鼠未见炎性细胞的浸润及“血管袖套"样情况；处于发病高峰期的EAE组小鼠脊髓组织切片内可见弥漫的炎性细胞浸润，个别的切片内存在“血管袖套”样改变；VD3组小鼠脊髓组织基本未见炎性细胞浸润征象。HE染色病理评分存在统计学差