遗传性凝血因子ⅶ缺陷症及wiskottaldrich综合征的临床及分子致病机理研究

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1、苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在——年一月解密后适用本规定。非涉密论文口论文作者签名：日期：子叫

2、、≯／7导师签名：多攀日期。「←遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症及Wiskott-Aldrich综合征的临床及分子致病机理研究中文摘要中文摘要近年，随着人类基因组序列图完成及分子生物学技术的发展，几乎所有凝血蛋白及血小板膜蛋白等基因已被克隆，这有助于深入了解探索其结构与功能的关系。目前已发现很多遗传性出血性疾病的基因异常，基因诊断是今后遗传性出血性疾病研究的发展方向。遗传性凝血因子Ⅶ缺陷为常染色体隐性出血性疾病，其发病率约为1／500000，仅次于血友病A、B，而且临床表现迥异。Wiskott-Aldrich综合征是WASP基因突变所致的X连锁隐性遗传

3、病，其临床特征为血小板减少伴小血小板，湿疹及免疫缺陷等。本研究对7例遗传性凝血因子Ⅶ及7例Wiskott．Aldrich综合征的家系成员进行基因诊断并对其致病机制进行研究。本研究分为两部分：第一部分遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症的分子机制研究第一节：7例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者及家系成员的临床与F7基因突变的研究用一期法及ELISA检测PT、凝血因子Ⅶ活性及抗原等凝血指标进行表型诊断；用DNA测序方法对先证者及家系成员F7基因的全部外显子、侧翼区及5’和3’非翻译区进行分析，寻找基因突变位点；应用PCR。RFLP对新发现地突变的先证者及其家系成员相

4、应基因片段进行酶切分析，证实测序所发现地突变；利用长链PCR分析无突变患者的基因组DNA排除大片段缺失；并用剪接分析软件分析剪接位点突变后效应。在7例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者中，PT明显延长，FⅦ活性水平均降低(<5％)，FⅦ抗原水平改变不一致，有的明显下降，有的仅轻度降低，其他凝血指标均J下常；7例遗传件FVII缺陷患者中发现7种基冈突变和3种F7基因多态性，其中18094C---T(GIn426X)、16750C—T(Ser250Phe)(以ProFVII的Met为+l位)为1中文摘要遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症及Wiskott-Aldric

5、h综合征的临床及分子致病机理研究国际首次报道，His408Gln，5076．5077DelCT两种纯合突变为国内首次报道，15975G--'A(IVS6-1G—A)、16039G—A(Ar9212Gin)，17908G—A(Ar9364Gln)国际均已见报道，IVS6．1G—A突变重复出现于4个无亲缘关系的家系，His408Gln在两个无血缘关系的家庭中。除两例纯合突变外，其余均为双重杂合性突变：l例新的基因多态性10081C—T，其杂合率为4％。其中5076．5077DelCT纯合子、Gln426X与IVS6．1G—A双杂合子患者临床出血表

6、现较重；Ser250Phe与IVS6．1G—A、His408Gln与时醴12Gln双杂合子患者出血症状较轻；His408Gln纯合子、Ar9364Gln与IVS6．1G—A双杂合子及仅发现IVS6．1G—A突变的患者及家系成员无明显临床出血表现。从上述结果可得出以下结论，7例遗传性FVII缺陷患者中发现了7种基因突变，其中2种突变为国际首次报道；IVS6．1G—A可能为中国汉族人的热点突变；但F7基因突变、FVll活性及抗原水平及临床表现无明显相关性。第二节新的错义突变Ser250Phe致遗传性凝血因子Ⅶ缺陷的分子机制Ser250Phe发生于

7、FVII的丝氨酸蛋白酶活性中心附近，影响蛋白构象，使其活性及分泌合成受到影响。利用J下常肝组织提取的mRNA构建正常(野生)FVIIcDNA真核表达载体(pcDNA3．1)，在此基础上利用PCR介导的质粒定点诱变技术，用一对反向互补的突变引物PCR扩增后，DpnI消化模板，然后转化到感受态细胞(DH5Q)中修复。用脂质体法(Lipofectamine2000)分别转染HEK293和CHO细胞，通过体外表达FⅦ活性及抗原的测定、WestemBlotting分析、高尔基／内质网定位的质粒及免疫荧光技术及分子模型分析等方法研究Ser250Phe致遗

8、传性凝血因子Ⅶ缺陷症的分子机制。研究结果碌示突变体Ser250Phe转染细胞后，在细胞裂解液中能检测到与野生型一致的FVll抗原量，但细胞培养上清中仅有极微量的FV