遗传性抗凝蛋白缺陷症致静脉血栓栓塞症的分子机制研究

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1、上海交通大学医学院硕士学位论文遗传性抗凝蛋白缺陷症致静脉血栓栓塞症的分子机制研究THEMOLECULARBASISOFVENOUSTHROMBOEMBOLISMCAUSEDBYHEREDITARYANTICOAGULANTPROTEINDEFICIENCY关键词：静脉血栓、基因突变、抗凝蛋白s缺陷症、抗凝蛋白C缺陷症、抗凝血酶缺陷症硕士研究生：方碧晴硕士生导师：张纪蔚教授导师组成员：张岚教授黄晓钟副教授梁卫副教授吕磊讲师学科专业：外科学（血管外科学）研究方向：遗传性静脉血栓栓塞症的基础研究申请学位类别：医学硕士（科研型）培养单位：上海交通大学医学院附属

2、仁济医院论文提交日期：2014年4月III上海交通大学医学院硕士学位论文遗传性抗凝蛋白缺陷症致静脉血栓栓塞症的分子机制研究摘要第一部分遗传性抗凝蛋白缺陷症在VTE人群中的发病率目的：探讨抗凝蛋白缺乏率和遗传性抗凝蛋白缺陷症在VTE人群中的发病率方法：收集277例临床上急慢性VTE患者的外周血。分别采用凝固法和发色底物法检测两组的抗凝蛋白活性（Antithrombinactivity，AT：A；ProteinSactivity，PS：A；ProteinCactivity，PC：A）。对抗凝蛋白活性较低者进行外周血基因测序分析，发现对蛋白结构有影响的基因突

3、变。用统计学方法计算出全部VTE患者中三种抗凝蛋白缺乏率和相应的基因缺陷率。结果：277例VTE病例中发现：AT、PC、PS活性缺乏率分别为16.00%、17.45%、17.09%，遗传性抗凝蛋白缺陷症(Antithrombindeficiency,HACPD)发生率分别为ATD1.5%、PCD6.2%、PSD0.7%。结论：VTE患者与正常人相比，三种抗凝蛋白活性缺乏率和基因缺陷率都明显高出10倍以上，说明HACPD是VTE发病的高危因素。关键词：抗凝蛋白、基因缺陷、遗传性、静脉血栓第二部分新杂合点错义突变致遗传性抗凝蛋白c缺陷症的分子机制研究目的：

4、探讨新杂合点突变致遗传性抗凝蛋白c缺陷症的分子机制方法：分析一临床血栓病例，抽提外周血DNA并做PCR扩增及核酸序列分析，构建野生型质粒（PCwt）和突变型质粒（PC-c.1157T>C），将质粒瞬时转染入hek-293t细胞内进行体外表达，rt-PCR观察突变pc在转录水平的变化，westernblot印迹检测质粒转染后细胞裂解液中PC抗原以及细胞外液分泌的PC含量，细胞免疫荧光染色检测PC在细胞内的分布情1上海交通大学医学院硕士学位论文况。结果：细胞免疫荧光验证质粒成功转染入HEK-293T细胞，rt-pcr：突变型质粒的mRNA水平显著高于野生型

5、；western印迹检测：PC-c.1157T>C质粒转染细胞裂解液中PC蛋白和PCwt质粒转染细胞间没有显著性差异，突变型质粒蛋白表达有上调趋势；细胞外液中野生型质粒转染细胞分泌的PC多于突变型，差异有统计学意义；激光共聚焦示：PC突变体质粒转染细胞表达的目的蛋白在内质网中聚集明显增加。结论：新杂合错义突变致遗传性抗凝蛋白C缺陷症的分子机制为PC在内质网内滞留，导致胞外PC分泌量减少，活性降低。关键词：静脉血栓、错义突变、抗凝蛋白C、抗凝蛋白C缺陷症第三部分新发无义突变致抗凝蛋白S缺陷症的分子机制研究目的：探讨新杂合点突变致遗传性抗凝蛋白S（Prot

6、einS，PS）缺陷症的分子机制。方法：分析一临床血栓病例并做家系调查，抽提外周血DNA并做PCR扩增及核酸序列分析，构建野生型质粒（PSwt）和突变型质粒（PS-c.1771delA），将质粒瞬时转染hek-293t细胞，rt-PCR观察突变PS在转录水平的变化，westernblot检测质粒转染后细胞裂解液中PS的表达量，Elisa检测观察质粒转染细胞外液分泌的PS含量，细胞免疫荧光染色检测PS在高尔基体内的分布情况。结果：在PROS1基因上发现一新发的无义突变PS-c.1771delA，家系调查显示本研究病例为一遗传性抗凝蛋白S缺陷症家系，野生型

7、质粒转染细胞裂解液中mRNA和PS的表达量显著高于突变型质粒转染细胞，Elisa检测到野生型质粒转染细胞外液分泌的PS显著多于突变型，激光共聚焦也进一步显示突变型质粒转染细胞的PS表达量明显少于野生型，突变质粒内的PS在高尔基体内的聚集明显少于野生型质粒表达蛋白。结论：本病例先证者患遗传性抗凝蛋白S缺陷症的分子机制可能是由于突变导致PS表达下降、分泌障碍，而后抗凝功能减弱，血栓形成风险增加。【关键词】静脉血栓、无义突变、抗凝蛋白S、抗凝蛋白s缺陷症2上海交通大学医学院硕士学位论文molecularmechanismsofvenousthromboemb

8、olismcausedbyhereditaryanticoagulantproteindefi