鬼臼毒素衍生物gmz-1体外抗肿瘤作用研究

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺_，‘；罱，o?0施_‘器＼碱雌轹刘舭师剿加彳誊澍河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：旁J亩q禾翩镬日㈣删删㈣㈣㈣Y1900岑4芎。目录中文摘要l英文摘要·4研究论文鬼臼毒素衍生物GMZ一1体外抗肿瘤作用研究吾智喜．．．．··8。日U舀。材料与方法9结果·26附图··34附表60讨论67结论71参考

2、文献··72综述克服多药耐药的微管蛋白抑制剂一75致谢86个人简历··87中文摘要鬼臼毒素衍生物GMZ．1体外抗肿瘤作用研究摘要目的：本文研究鬼臼毒素新型衍生物GMZ．1对肿瘤细胞的体外杀伤和抑制生长作用，并对其发挥作用的机制进行初步探索。方法：lMTT法检测GMZ．1的体外抗肿瘤活性采用MTT法测定GMZ．1对多种肿瘤细胞(Hela、A549、MCF一7、HepG一2、SKOV3、BGC一823、MGC一803、KB、KBV200、K562、K562／A02)及正常细胞(FB)抑制作用的IC50值。2GMZ一1诱导肿瘤细胞凋亡的检测吉姆

3、萨染色(Giemsastaining)和荧光染色(Heochst33342staining)观察GMZ一1K562／A02细胞作用的形态学变化；琼脂糖凝胶电泳观察G抛．1对KBV200细胞染色体DNA的影响；流式细胞术(FCM)测定经GMZ．1处理后K562／A02细胞凋亡率的变化。3流式细胞术(FCM)分析GMZ．1对K562／A02细胞周期的影响4RT—PCR检测GMZ—l对K562／A02细胞p2l、p53、Bax、Caspase．3、PCNA、CyclinA、CyclinBl、Mdr-1基因mRNA表达的影响5Westem-blo

4、t检测GMZ．1对K562／A02细胞Caspase．3、Mdr蛋白表达的影响6GMZ一1对HepG．2细胞微管聚合的影响免疫荧光(Immunofluorescence)观察经GMZ．1处理后HepG．2细胞微管形态变化；荧光半定量测定GMZ．1对HepG一2细胞微管聚合影响的抑制率及IC50值。7小鼠急性毒性试验初步考察GMZ一1体内毒性结果：1GMZ．1的体外抗肿瘤活性经MTT法测定发现GMZ．1对多种肿瘤细胞均有较强杀伤作用和抑制生长活性，IC50值范围为O．066岬ol／L～O．27岬ol／L，明显强于同类已上市抗肿瘤药物依托泊苷

5、(IC50值范围为1．06岬ol／L～14．1岬ol／L)，且对于中文摘要同～种细胞的耐药株与非耐药株敏感性差别明显弱于依托泊苷，有较好的抗多药耐药作用。同时对人正常成纤维细胞(FB)具有较低毒性，提示GMZ．1对肿瘤细胞有很好选择性。通过绘制K562／A02细胞生长曲线，发现低浓度GMZ。1作用下细胞存活数量高于高浓度作用下的细胞存活数量，提示GMZ．1的作用具有一定的剂量依赖性。2G抛一l诱导肿瘤细胞凋亡GMZ一1能够诱导K562／A02细胞凋亡，对经过GMZ．1处理后的K562／A02细胞进行染色(所用染料为Giemsa和Hoech

6、st33342)，并利用光学和荧光显微镜观察。光学显微镜下发现细胞核染色质发生聚集固缩，细胞核碎裂成多个染色浓密的凋亡小体；荧光显微镜下发现同正常细胞微弱蓝色荧光相比，GMZ．1处理组细胞出现强亮的蓝色荧光，细胞核呈致密浓染。这些都是细胞发生凋亡的典型形态，且高浓度GMZ．1处理后出现凋亡细胞的数量多于低浓度。提取经GMZ．1处理后KBV200细胞的总DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，发现其泳道呈一条一条的梯子状，为细胞发生凋亡所出现的典型的“DNA梯子"(DNAladder)。通过流式细胞仪对GMZ．1处理后的K562／A02细胞凋亡率的测定

7、，发现在一定浓度和时间范围内，G抛．1处理后的细胞凋亡率高于正常细胞凋亡率，且凋亡率随着浓度的增大和时间的增多而变大。3GMZ．1对K562／A02细胞增值周期的影响采用流式细胞仪分析了经G抛．1处理后K562／A02细胞的周期分布情况，结果显示，在一定浓度范围内，GMZ．1作用12h、24h、36h，细胞都发生G2+M期阻滞。4GMZ．1对K562／A02细胞凋亡相关基因p21、p53、Bax、Caspase．3，增殖细胞核抗原PCNA，细胞周期素CyclinA、CyclinB1，多药耐药基因Mdr-1等mRNA表达的影响ImPCR分析

8、结果显示，G抛．1通过上调抑癌基因p2l、p53、BaxmRNA的表达而发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用；通过上调CyclinA，下调CyclinBl、PCNA而发挥抑制肿瘤细胞分裂增殖的作用；通过