酵母生物转化生产s—腺苷—l—蛋氨酸辅产谷胱甘肽机理及工艺的研究

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1、——堑婆奎堂堕主兰焦笙窒塑墨摘要本文主要涉及S一腺苷一L-蛋氨酸(S-adenosyl—L—methionine，SAM—e或AdoMet，SAM)和谷胱甘肽(GSH)的生物合成、SAM的分离提纯及稳定盐产品的制各工艺与机理研究。论文对SAM和GSH的性质、药理及应用、制备工艺的研究进展进行了详细的综述与分析，在此基础上确定了论文的研究内容。通过深入细致的研究工作，取得的主要研究成果包括：l、利用啤酒厂废酵母，在外加L一蛋氨酸和葡萄糖的条件下，实现了酵母细胞同时生产SAM和GSH的目标，证明了在加入蛋氨酸生产SAM的同时得到了提

2、高的GSH产量。确定了利用废酵母生产SAM的最适条件为：温度27～30℃内，pH60，K+浓度为012M。当L．蛋氨酸加入量在0．7g／1以上时，摇瓶水平SAM的产量iJ_达25—40mg．g～，L．蛋氨酸转化率达30％以上，体积产量可达600～800mg／l。在l5升发酵罐水平，当通气量为30vvm、搅拌速率500rpm，L．蛋氨酸浓度1．0g／l，葡萄糖浓度30g／l以及酵母密度(DCW)30g／l时，SAM的产量达45．8mg／g，体积产量1198mg／l，蛋氨酸转化率约44％，同时胞内还积累了17．0mg／g的GSH。实

3、验结果表明。我国有丰富的啤酒厂废酵母资源，利用啤酒厂废酵母生产SAM及GSH可以实现废酵母的综合利用、提高废酵母的附加价值，具有良好的工业化应用

4、j{『景。2、通过对酵母菌株的产SAM能力的筛选，发现酿酒酵母ZJUSl在补加L．蛋氨酸的条件下具有较高的SAM生产能力；确定了利用酿酒酵母ZJUSl在间歇培养约一天后直接向发酵液内补加1．O∥l蛋氨酸、30g／l葡萄糖的培养一转化两步法同时生产SAM和GSH的策略；在摇瓶水平对转化阶段的操作条件进行了考察，确定了最适补加葡萄糖浓度为30∥l，最适补加L一蛋氨酸浓度为1．0g／1．对S

5、AM和GSH合成的最适初始转化pH分别为5．0和6．0。15升发酵罐内培养一转化两步法实验数据表明，较高的溶氧水平及初始酵母密度有利于促进SAM产量的提高，而GSH在酵母胞内的积累表现在SAM合成的后期：在高溶氧水平(D0>40％)，L．蛋氨酸的转化率高达37．4％，SAM体积产量达1003．9mg／l，干细胞产率为82．2mg／g，GSH的最高产量达O．92％(g／g)，体浙江大学博士学位论文摘要积产量达140rag／1。实验表明，培养酵母的SAM合成能力大大高于啤酒厂废酵母，但GSH积累水平大大低于啤酒厂废酵母。3、对SAM

6、和GSH的合成机理、能量代谢在SAM和GSH合成中的重要作用、溶氧对酵母细胞好氧呼吸和厌氧代谢的影响及其对SAM和GSH积累的影响机理进行了分析和讨论，在此基础上，建立了代谢溢流模型描述酵母细胞生长、底物消耗和产品形成的动力学，模型较好地描述了间歇培养一转化过程。上述工作为进一步改进酵母细胞同时积累SAM和GSH的工艺提供了理论基础，为利用代谢工程改造酵母细胞指出了方向。4、研究丌发了利用苦味酸代替文献中采用的苦酮酸沉淀分离SAM，并结合溶剂萃取、溶解以及结晶方法的SAM分离和提纯制备工艺。结果表明，苦味酸是一种选择性较好的沉淀

7、剂，沉淀步骤得率在90％以上，制备SAM的硫酸盐的总得率在60％以上，而硫酸对甲苯磺酸双盐的得率在50％以上，产物的纯度达到了95％以上，已经达到了国外同类产品的质量指标。5、通过筛选，获得了对SAM有较好选择性离子交换能力、较易洗脱和再生的争光D113弱酸型阳离子树脂，研究了温度、pH等对SAM离子交换的影响，根据SAM在弱酸阳离子树脂D113上的等温交换平衡行为表现出较强的可逆性，考虑到交换基(．COOH)的弱电解质性质以及结合Donan膜平衡理论，建立了考虑pH影响的可逆离子交换平衡模型，该模型可以较好地描述SAM平衡浓度

8、、pH对离子交换平衡的影响；通过对动态离子交换过程的研究，得到了SAM在D113树脂内的有效扩散系数的数量级为1．0E一9cm2／s～1．0E．8cm2／s。6、研究开发了利用D113离子交换树脂结合聚苯乙烯类SD300脱色树脂的SAM分离提纯工艺，该工艺可以得到98％纯度的SAM，D113弱酸型阳离子树脂柱分离SAM的得率在90％以上，处理量为41．8gSAM／liter树脂：SD300脱色树脂柱的SAM得率达到了95％以上。总之，通过本论文的研究工作，基本确定了利用啤酒厂废酵母和培养酵母生产SAM和GSH的生物转化工艺：提出

9、了以苦味酸沉淀和离子交换分离为核心的两条分离提纯SAM的工艺路线；建立了生物转化和离子交换平衡的物理模型；为在我国实现SAM的工业化生产打下了良好的基础。浙江大学博士学位论文摘要关键词：s．腺苷．L．蛋氨酸谷胱甘肽酵母L一蛋氨酸生物合成代谢溢流模型苦味酸沉淀离子