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《S-腺苷甲硫氨酸生产工艺优化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、S-腺苷甲硫氨酸菌株的筛选及发酵工艺优化摘要以45株酵母菌株作为出发菌株,筛选出2株高产SAM(S-腺苷甲硫氨酸)的酿酒酵母菌株(A12A、A18A),以该2株酿酒酵母菌株为对象,研究发酵温度、发酵液初始pH值、摇床转速以及发酵时间对菌体产量和SAM产量的影响,并优化发酵工艺条件,以提高SAM的产量。结果表明:发酵温度、发酵液初始pH值、摇床转速和发酵时间对菌体产量和SAM产量均有显著影响。经正交试验优化,2株酿酒酵母菌株产SAM的最佳发酵条件为25e、发酵液初始pH值5.0、摇床转速225r/min、发酵时间108h,在该发酵条件下,酿酒
2、酵母菌株A18A产SAM最高量达2.54g/L,较优化前提高1.17倍。关键词酿酒酵母;S-腺苷甲硫氨酸;发酵工艺S-腺苷甲硫氨酸(SAM)在生物体内具有转甲基、转氨丙基、转硫[1]等作用,对人体许多疾病的预防和治疗都有积极作用[2]。自1952年SAM首次被意大利科学家分离出以来,在欧洲一直将其作为抑郁症和关节炎的处方治疗药物,市场需求量大大增加[3]。在培养基中添加一定量的L-甲硫氨酸,能够在细胞内催化ATP与L-甲硫氨酸反应,合成较高浓度的SAM。因此,先通过微生物发酵,再从菌体中提取精制SAM是目前其工业化生产的主要途径。酿酒酵母属
3、[4-5]、毕赤酵母属[6]、大肠杆菌[7]等微生物可在体内合成SAM。Gawe等[8]考察了10种微生物产SAM的差异,Shiozaki等[9]筛选出S.sake作为高产SAM的菌株[2]。目前学者研究了培养基组成、发酵方式[10]等对SAM产量的影响,如Shiozaki[1]采用10mL培养基的小量发酵法获得了1.55g/L的SAM,叶盛[11]利用YPD培养基,经发酵条件优化,获得了1.74g/L的SAM。基于酵母的安全性及高表达性,笔者从45株酵母菌株中筛选得到2株高产SAM的菌株,编号为A12A和A18A,继而以该2株菌株为对象,
4、研究发酵条件对菌体产量和SAM产量的影响,优化发酵工艺条件,以提高SAM的产量。1材料与方法1.1试验材料1)菌株来源。45株酵母中有44株由中国科学院微生物研究所提供,1株为笔者所在实验室保藏。2)培养基。YPD完全培养基(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,葡萄糖20,琼脂20;自来水配制,pH值,自然;121e灭菌20min。3)种子培养基(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,葡萄糖20;自来水配制,pH值,自然;121e灭菌20min。4)发酵培养基[11](g/L):葡萄糖10,酵母粉3,蛋白胨5,L-甲硫氨酸3;自来水配制,121e
5、灭菌20min。1.2试验方法1)发酵方法。菌株筛选:从新鲜斜面接种1环酵母[12]于250mL摇瓶(溶液体积25mL)中,在一定温度和转速下摇床培养一定时间,取样测定发酵液菌体产量和SAM产量。发酵过程:种子培养基按10%接种量接种于250mL摇瓶(溶液体积25mL)中,在一定温度和转速下摇床培养一定时间,取样测定发酵液菌体产量和SAM产量。2)样液的制备。参考文献[13],取25mL发酵液于12000r/min离心10min,弃去上清液,然后添加1.5mol/L的高氯酸,并在室温下振荡提取30min,进行第2次离心(12000r/min
6、,10min),用25mm滤膜上过滤清液,最后用pH值3.0的盐酸将滤液稀释至一定浓度。3)HPLC测定方法。参考文献[14],色谱柱为SupeloC18反相柱(250mm@4.6mm,5Lm);流动相为甲醇:(40mmoL/LNH4H2PO4-8mmoL/L庚烷磺酸钠)=30B70(V/V),流动相pH值用稀盐酸调至3.0;流速1.0mL/min;柱温35e;灵敏度0.004AUFS;检测波长257nm;进样体积20LL。根据标准品峰面积与产量关系作出标准曲线,样品在257nm的峰面积代入标准曲线换算得到SAM的产量。4)菌体产量的测定。
7、取25mL发酵液,滤纸过滤得净菌后,(105?1)e烘至恒质量后称质量[15]。5)数据分析。应用SAS软件和Excel软件对数据进行分析,试验结果取3次平行测量的平均值。2结果与分析2.1高产SAM菌株的筛选45株酵母菌株接种于pH值5.0的发酵培养基,发酵温度25e,摇床转速250r/min,发酵时间96h,通过自然对比法进行产量筛选试验,结果见表1。从表1的结果看出,菌株生产能力较好的有12、18、24、41号。再将表现较好的4株菌株复筛,获得产SAM较高的12、18号菌株。在后续试验中对18、12号菌株进行最佳发酵条件的优化。120
8、.0844.52152.72?0.03a2.75?0.07e1.28?0.04a1.76?0.09de220.0965.02252.76?0.07a2.81?0.04de0.96
