近视眼发病机制的研究——视黄酸对巩膜成纤维细胞基因表达的影响

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1、近视眼发病机制的研究——视黄酸对巩膜成纤维细胞基因表达的影响中山大学博士学位论文第一部分透镜诱导豚鼠屈光不正的实验研究目的：观察凹透镜和凸透镜对豚鼠眼球生长和屈光变化的影响，建立透镜诱导型屈光不正动物模型，探讨CRALBP在实验性近视眼巩膜中的作用。方法：3~4周龄有色豚鼠47只，随机分成7组，右眼分别戴不同度数的凸或凹透镜，其左眼作为对照眼，戴镜前和戴镜后第ll天分别测量其眼轴长度、屈光度，观察其变化。用HE染色测量诱导近视眼巩膜和对照眼巩膜的厚度变化。通过免疫组化和蛋白质免疫印迹的方法检测CRALBP在豚鼠诱导近视眼和对照眼的视网膜、脉络膜和巩膜的表达。结果：戴镜后第11天，与

2、戴镜前相比，戴+4．00D、+8．00D组的豚鼠眼分别增加了+1．46D与+1．58D的相对远视(尸<0．05)：戴-4．00D、．8．00D、．15．00D组的豚鼠分别增加了．2．92D、．3．17D、．3．10D的相对近视(尸<0．01)：而戴0．00D、一2．00D组的豚鼠的屈光度差异无统计学意义(户>0．05)。所有七组豚鼠的眼轴长度在实验眼和对照眼之间差异无统计学意义(尸>0．05)。分别将对照眼和透镜诱导近视眼后极部巩膜HE染色，结果显示诱导近视眼巩膜比对照眼巩膜变薄。免疫组化结果显示，和对照眼相比，诱导近视眼的CRALBP在脉络膜和巩膜中的表达明显降低，在视网膜中的表

3、达升高。Westernblotting结果和免疫组化结果相对应，CRALBP在诱导近视眼巩膜中的表达明显降低。结论：豚鼠眼球生长发育受透镜影响，可被用来建立一种简单经济的屈光不正动物模型。和对照眼相比较，诱导近视眼巩膜变薄。CRALBP在眼球发育以及近视眼形成过程中可能参与了RA的转运与调节。．Ⅱ．近视眼发病机制的研究——视黄酸对巩膜成纤维细胞基因表达的影响中山大学博士学位论文第二部分视黄酸对体外人巩膜成纤维细胞影响的研究目的：探讨全反式视黄酸(all—transretinoicacidat—RA)对培养的人巩膜成纤维细胞(humanscleralfibroblastsHSF)的形

4、态、增殖以及细胞周期的影响，从而探讨at—RA在近视眼巩膜重塑中的作用。方法：HSF传代至第四代后以1X105／孔的密度接种于96孔板或以1X106的密度接种于25cm2的培养瓶，以含IO％FBS的DMEM／F12培养液培养，当细胞长满瓶子80％'--'90％时，培养液转换为含浓度为5×10～、lX10葡、2×10—5M，5×10一5Mat-RA的DMEM／F12。以未加RA组作正常对照，于12、24、48、72小时后观察HSF形态；96孔板以浓度1X10～，1X10一‰，l×10啊，l×lO一7M，1×lO‘8Mat—RA作用HSF24、48、72小时后用MTT法测定其增殖情况；

5、以浓度5×10～、1X10翱的at-RA作用于HSF，24、48d,时后用FCM检测细胞周期情况。结果：不同at—RA的剂量对HSF的形态、增殖有程度不同的负性影响。At—RA刺激后HSF细胞数目减少，细胞收缩，突起减少，部分裂解，胞浆内有空泡和颗粒形成，细胞之间的间隙增宽，细胞变得细长，呈束状或不规则排列。在高浓度(1×10一‰)时，细胞大部分裂解，看不到完整的细胞存在，只有裂解的碎片。MTT法显示at—RA对巩膜成纤维细胞有明显的抑制作用，该效应呈剂量依赖性反应。FCM结果显示经at—RA刺激HSF24、48d,时后，和对照组比较，随着at—RA浓度和时间的增加，GO／G1期细

6、胞的比例逐渐上升，而S期和G2期细胞比例相应下降，细胞被阻滞在GO／G1期。结论：RA可以抑制体外培养的人巩膜成纤维细胞增殖和DNA合成，RA的浓度变化最终引起巩膜成纤维细胞形态和功能的改变。RA可能是近视发生过程中的信使物质。．ⅡI．近视眼发病机制的研究——视黄酸对巩膜成纤维细胞基因表达的影响中山大学博士学位论文第三部分视黄酸对人巩膜成纤维细胞中CRABP、CRALBP、MMP-9和TIMP-1表达的影响目的：利用基因芯片技术筛选RA培养HSF后相关基因群的表达变化，以探讨RA作用于HSF的相关通路。用不同浓度RA培养HSF后，HSF表达CRABP、CRALBP、MMP-9和TI

7、MP-1的变化，以从分子水平解释RA的作用机制。方法：HSF传代至第四代后以lX106的密度接种于25cm2的培养瓶，以含10％FBS的D她M／F12培养液培养24小时后，培养液转换为含浓度为l×10-5MRA的D娅M／F12，以未加RA组作正常对照，继续培养48后用Trizol一步法提取细胞中的总P,NA，对样品P．JqA进行荧光标记，通过杂交与清洗，对标记的人类全基因细寡核苷酸芯片进行扫描，采用图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号，然后对芯片上