角膜新生血管相关的长链非编码rna(lncrnas)的鉴定及其调控机制研究

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南京医科大学博士学位论文分类号：R77单位代码：10312密级：学号：20112711南京医斜大学博士学位论文(专业学位)题目：盘送逝生血笪担差鲍筮鲑韭缉翌塞堂!!旦垡基堂曼2鲍鉴塞丛基迥控扭剑狃窒万方数据 南京医科大学博士学位论文南京医科大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除了文中特剐加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：t豉秒苞日期：矽修年歹月≯z日导师签名：妒日期：矿‘寸年朗t1学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于(请在以下相应方框内打“4”)：1、保密口，在一年解密后适用本授权书。2、不保密口。作者签名：《虽覆日期：少了聿J月7阳导师签名：日期：∥，年7月p吒万方数据 南京医科大学博士学位论文目录中文摘要1英文摘要3前言6正文91第一部分角膜新生血管相关的长链非编码RNA(LncRNAs)的鉴定91．材料与方法92．结果143．讨论242第二部分NR033585对人脐静脉内皮细胞功能的影响261．材料与方法262．结果333．{，寸{念．．．．．．．．．．．．．．．．．．。。．．．．．．．．．．．．．363．结论374．参考文献38综述与参考文献42附录一：中英文缩略词74附录二：文章发表情况75致谢76万方数据 南京医科大学博士学位论文角膜新生血管相关的长链非编码RNA(1ncRNAs)的鉴定及其调控机制研究博士研究生：黄瑾导师：蒋沁中文摘要目的：正常的角膜组织没有血管，周围血管终止于角膜缘，在角膜缘形成血管网，营养成分由此扩散入角膜。无血管化是角膜的主要特征，也是其完全透明，维持正常视力的重要因素。在炎症、感染、化学伤、变性等疾病中或由于眼科手术，维持角膜无血管的平衡因素被破坏，角膜会发生病理性新生血管，导致角膜丧失透明，从而最终影响视力，同时角膜新生血管(cornealneovascularization，CN)也是角膜移植手术发生排斥的高危因素。长链非编码RNA(1ncRNAs)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，转录水平低于蛋白质编码基因，具有组织特异性。它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控众多生物学过程。CN发病机制复杂，受到各个基因层面的调控，目前对lncRNAs在CN中的研究尚在起步阶段，有必要筛选和鉴定与CN有关的lncRNAs，阐明其作用机制，为CN的治疗提供新的药物靶点。本论文旨在建立小鼠的新生血管模型，鉴定小鼠新生血管角膜相关的lncRNAs，并研究其在CN发生发展中的潜在的调控机制。方I法：建立碱烧伤诱导的小鼠角膜新生血管模型，采用lncRNAs微阵列基因芯片技术分析lncRNAs在正常角膜和新生血管化角膜(CN)组织的表达谱，筛选差异表达的lncRNAs；根据Pearson相关性分析，构建1ncRNAs／mRNA共表达网络；通过万方数据 南京医科大学博士学位论文基因本体(GO)的富集分析和pathway分析等生物信息学技术，探讨lncRNAs／mRNA共表达基因在角膜新生血管发生的作用机制及可能的病理途经：根据芯片检测结果，筛选了20个差异表达显著的incRNAs，对两组角膜样本用RealTimePCR验证芯片检测结果，同时检测了抗血管生成因子(PDGF和endostadin)和促血管生成因子(VEGF及iNOS)的表达，分析这些相关的lncRNAs的表达规律。分别选取差异表达最显著的上调、下调lncRNAs作为研究靶点，临床采集角膜炎、化学伤、外伤患者的角膜样本，采用RealTime—PCR，对筛选出的角膜新生血管相关的靶点lncRNAs进行表达分析验证，同时检测样本促血管生长因子(VEGF，Ang一2，MMP一9)和抗血管生长因子(PDGF)的表达，并与上述两条靶点lncRNAs的表达趋势进行比较，分析这两条相关incRNAs的表达规律。利用人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)，通过设置空白对照组、h202组、H20：+ScrsiRNA组和H。0z+NR一033585siRNA组，分别进行Hoechst33342染色、JC—l染色、PI染色和Ki67检测，判断在氧化应激状态下，人同源lncRNAsNR033585对(HUVEC)活力、增殖的影响，在分子水平探讨其潜在的调控机制。结果动物模型中，通过incRNAs基因芯片技术，分析CN组和正常组样品的lncRNAs表达谱，筛选差异有统计学意义(P1．8，可以满足实验要求。②为进一步确认RNA质量，辅以RNA电泳检测。配制1％的琼脂糖凝胶，取5IxlRNA原液与1u16x核酸电泳上样缓冲液混匀，上样，连接水平电泳槽和电泳仪开始电泳。电泳结束后，将凝胶放在凝胶成像系统中观察，拍照。一般如果28S和18S条带明亮、清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，则认为RNA的质量良好。9)检测RNA浓度：根据紫外分光光度计测定的260nm下的吸光值，按下列公式计算RNA浓度：RNA原液浓度=OD260×稀释倍数×40(ng／p1)。万方数据 南京医科大学博士学位论文2．3lncRNAs微阵列基因芯片检测及数据分析每3例角膜的RNA标本混合为一组以减少个体的差异性。lncRNA微阵列基因检测采用安捷伦阵列平台，即小鼠基因表达谱芯片(产品编号94852a；安捷伦公司)，包括39430个mRNA和16251个lncRNAs的探针，这些lncRNAs来自最备受推崇的公共转录数据库及著名出版社。具体步骤为1011g总RNA使用上标加直接cDNA标记系统(Invitrogen公司)进行标记，然后进行芯片杂交。芯片操作由上海生物芯片公司根据标准流程进行标记和杂交。安捷伦芯片扫描仪进行基因芯片扫描，并使用安捷伦特征提取软件(FEl0．5版)进行数据分析，用分位数和强多芯片平均法对基因表达数据归一化，lncRNAs微阵列数据解读和初步分析使用GeneSpringGX软件(安捷伦公司)。利用火山图筛选Hj变化倍数在2．0倍以上的差异表达的JncRNAs，按lneRNAs表达水平进行聚类分析。GO分析和Pathway分析检测差异表达的mRNA，Pathway分析所用的数据库为KEGG数据库(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomesdatabase)。2．4候选lncRNAs基因的表达分析(RealTime—PCR验证)根据芯片检测结果，筛选了20个差异表达显著的lncRNks，对两组角膜样本用RealTime—PCR验证芯片检测结果，同时检测了抗血管生成因子(PDGF和endostadin)和促血管生成因子(VEGF及iNOS)的表达，分析这些相关的lncRNAs的表达规律。具体操作为将2．2步骤提取的RNA，经DNaseI处理(Sigma公司)去除污染的基因组DNA。使用cDNA第一链合成试剂盒(FirstStrandeDNASynthesisKit，Takara公司)将共计lug的RNA逆转录为cDNA，再经RT—PCR扩增目的片段，对特异性的PCR产物的溶解曲线进行分析。基于2。△“相对定量分析法计算出这些候选基因在组织中的相对表达量，并与芯片结果进行比较，内参为甘油醛一3一磷酸脱氧酶(glyceraldehyde一3一phosphatedehydrogense，GAPDH)12。2．5生物信息学分析为了揭示lncRNAs与蛋白编码基因共表达的作用机制，将这些mRNA输入至万方数据 南京医科大学博士学位论文DAVID生物信息数据库(DAVID：http：／／david．abcc．ncifcrf．gov)进行注释和功能分析，包括基因集合富集分析，信号通道分析和基因组共定位分析1。3。2．6临床样本收集，验证芯片检测结果临床研究经由南京医科大学伦理委员会批准，病人签署知情同意书。手术样本的操作遵循赫尔辛基宣言，感染性角膜炎(8例)和角膜化学伤患者(6例)在行穿透性角膜移植术中取下的病变角膜片。这些角膜片在至少2个象限出现明显的血管化，无血管的角膜取自遭受严重外伤的眼球(4例)。分别选取差异表达最显著的上调、下调IncRNAs作为研究靶点(上调最显著：人同源NR033585；下调最显著：人同源chr8：129102060-129109035A反链)，对上述临床采集的角膜样本进行RealTime-PeR检测，对筛选出的角膜新生血管相关的靶点lncRNAs进行表达分析验证，同时检测样本促血管生长因子(VEGF，Ang一2，MMP一9)和抗血管生长因子(PDGF)的表达，并与上述两条靶点incRNAs的表达趋势进行比较，分析这两条相关lncRNAs的表达规律。3统计学分析应用SPSSl7．0统计软件对实验数据进行处理，两组间比较采用两样本T检验和单因素方差分析，PrO．05视为差异有统计学意义。万方数据 南京医科大学博士学位论文结果1小鼠角膜新生血管诱导观察lmol／1NaOH浸润小鼠中央角膜区导致角膜新生血管化，24h后可以观察到急性炎症反应，48h后可见新生血管自角膜缘血管网向中心角膜区生长(图1A)。NormalCN图1A：C57BL／6雄性小鼠碱烧伤模型2总RNA质量分析分别对CN组和正常角膜组的角膜样本提取总RNA，用紫外分光光度计测定其在260hm，230hm，280nm的吸光度。吸光度OD260／OD280比值分别为2．06(CN组)和2．11(正常组)，0D260：0D230的比值两组都超过1．9，说明提取的RNAs纯度较高。3lncRNAs微阵列芯片杂交检测结果为了揭示lncRNAs在角膜新生血管发生中的潜在作用机制，我们分别对CN组和正常组的角膜标本进行了高通量lncRNAs的微阵列基因芯片检测。3．1箱线图(boxplot)显示不做任何假设的统计分布的样本之间的差异。标准化后，正常组与CN组之间的l092分布率结果，见图1B。14万方数据 南京医科大学博士学位论文晴o=一再，萱一蚺c3c一-墨N=再二七oz图1B：箱线图显示lncRNAs表达谱的分布。标准化处理后，不同样本组l092的分布率如图显示。箱式图有一条中心线和两尾。中心线表示数据的中位数，而尾部代表的上部和下部的四分位数。3．2散点图(scatter—plot)显示了在转录水平样本具有相似性的总体趋势。如图1c所示，生物学重复显示相似的转录水平(正常组与正常组，CN组和cN组)，而正常组与CN组之间出现显著的lncRNAs的差异性表达。上述结果表明，该芯片分析是高质量完成。从整体上看，lncRNAs的表达，在正常组与CN组间存在明显的差异性。NonnaINorntlaICN图1C：散点图比较正常组和CN组lncRNA表达的差异性。万方数据 南京医科大学博士学位论文3．3正常组与cN组之问lncRNAs差异性表达利用芯片比较分析CN组和正常组样品的lncRNAs表达谱，差异倍数≥3．0被认为存在差异性表达。图2A显示利用火山图(volcanoplot)筛选差异有统计学意义(P<0．05)并且变化倍数在3．0倍以上的lncRNAs，共计154条，其中下调的共60条，上调的共94条(CN组比正常组)。4～瓣一r1jj3-；l?。0．’i一一●1『j一o：一再>a『口3um【．Jou2。0≥j一：一≤。，o■。。鋈震o躲旷：o』■。鼍，■W甬圃★蜊1。口、!}1亡口C■tH日———a蠲强疑￥强穗∞苗戮黪。。1．ao|-一ooc再。车一c矗一∞骠醪雹-6-4-20246L092Foldchange(NormalVsNeovascularization)图2A：火山图显示正常组和CN组相比，表达明显差异的lncRNAs，红点表示变化量超过3倍的lncRNAs，灰点表示表达变化不明显的lncRNAs。万方数据 南京医科大学博士学位论文4聚类分析结果～鞠—●—Ib正常组则聚集在另一个分支上(图2B)。按照lncRNAs的表达水平进一步行聚类分析，cN组聚集在同～个分支上，5E；8笙主2霞园羞錾豳—r—’1÷r_fr．一!_争叶叶ro-T■一箧益銎蕊图2B：聚类分析热图显示正常组和cN组lncRNA表达水平的差异。图顶部的色阶图显示的是不同样本中lncRNAs的相对表达水平。红色提示表达水平高于0，绿色则表示表达水平低于0。C：正常组，N：新生血管组5对lncRNAs共表达mRNA的基因富集和信号通路分析5．1lncRNA／mRNA共表达网络构建lncRNAs芯片分析不仅可以提供正常组和cN组lncRNAs表达的信息，也可以提供mRNA的表达信息，由此，根据表达趋势，我们构建了lncRNA／mRNA共表达网络，并研究mRNA和lncRNAs之间可能存在的相互作用。相关性分析确定了388个lncRNA／mRNA共表达基因，包括112个下调基因，276上调基因。zkq20151027万方数据 南京医科大学博士学位论文5．2基因富集分析(GO)结果G0分析是根据基因本体论，将基因分成三类：生物学进程类，细胞组分类，分子功能类。实验发现，高富集lncRMAs／mRNA共表达基因，在细胞外区(本体：细胞组分类；图3A)，DNA结合(本体论：分子功能类；图3B)，和免疫反应(本体论：生物学进程类；图3C)。图3A—C：GO富集分析结果，根据基因本体论，将基因分成三类：生物学进程类(A)，细胞组分类(B)，分子功能类(c)。zkq20151027万方数据 南京医科大学博士学位论文5．3Pathway通路分析结果KEGG数据库分析结果显示lncRNAs潜在的靶基因mRNA可能参与多个信号通路，如癌症信号通路，MAPK信号通路，钙信号通路，神经活性的配体一受体相互作用，缝隙连接，Toll样受体信号通路和Wnt信号通路。图3D显示的是其中的癌症信号通路。图3D：KEGG信号通路分析lncRNAs共表达编码蛋白主要富集与癌症信号通道zkq20151027万方数据 南京医科大学博士学位论文6RealTime—PCR验证候选lncRNAs摹因的表达分析对20条感兴趣的lncRNAs进行RT—PCR检测，评价lncRNAs芯片结果的日j-靠性，发现其中17条lncRNAs在基因芯片和组织表达水平基本一致，住两组间存在差异性表达(表1)。Table1：Verificationofmicroarraydatausingreal-timePCR表1：RealTime—PCR验证候选lncRNAs基因的表达分析20zkq20151027万方数据 南京医科大学博士学位论文7lncRNAs和CN发生的相关性研究我们随机选择了3个上调基因和3个下调的lncRNAs，与检测出的抗血管生成因子(PDGF和血管内皮抑素)和促血管生成因子(VEGF及iNOS)“““5的表达模式进行比较。发现，这些上调lncRNAs表现出类似促血管生成因子的表达模式，而下调lncRNAs具有相似的抗血管生成因子表达模式，(图4)，表明这些失调的lncRNAs在体内可能存在抗血管生成或促进血管生成的作用。拍吣眨84O4{坦怕图4随机选择3个上调lncRNAs和3个下调的lncRNAs，比较他们与realtimePCR检测的抗血管生成因子(PDGF和血管内皮抑素)和促血管生成因子(VEGF及iNOS)的表达模式zkq20151027万方数据 南京医科大学博士学位论文8临床相关性分析为了分析lncRNAs和CN发生的相关性，我们对化学伤、角膜炎和严重外伤患者的人类同源的lncRNAsNR一033585及lncRNAchr8：129102060—129109035A反义链进行了实时的realtimePCR检测。结果显示：新生血管角膜的NR033585的表达水平明显上调，相反，chr8：129102060—129109035A反义链表达水平明显卜调(图5)；我们也发现，这类患者中，促血管牛成因子，如VEGF，Ang一2，MMP-9明显被激活，而抗血管生成因子，PDGF水平则明显下降(图4C—F)。上述结果显示在cN发生发展的病理过程中，NR033585与促血管生长囚子有类似的表达趋势，chr8：129102060129109035A反链与抗血管生长因子有类似的表达趋势，由此可推断NR一033585起促血管生成作用，chr8：129102060—129109035A反链则起到抑制血管生成的作用。zkq20151027万方数据 南京医科大学博士学位论文图4：无血管和新生血管角膜的人同源1ncRNAs差异性表达。分别对8例角膜炎，6例化学伤和4例外伤性角膜行real—timePER检测人同源NR一033585(A)和lncRNAchr8：129102060—129109035A反义链表达水平(B)，及VEGF(C)，Ang一2(D)，M】IvlP一9(E)，PDGF(F)表达水平的检测23万方数据 南京医科大学博士学位论文讨论健康的角膜是无血管，透明的。慢性缺氧或各种炎症刺激，如细菌性角膜炎，角膜碱烧伤及移植排斥，会导致CN的发生。。CN通常是由多种病理因素引起的多种病理过程的结果。尽管己经取得了巨大的进展，但CN发病的分子机制仍不清楚“”1。‘。本实验中，我们对小鼠CN模型IncRNAs的基因表达谱进行分析。发现154条lncRNA异常表达。此外，分别对外伤所致的无血管角膜和新生血管化的角膜组织检测人类基因NR033585和1incRNA：chr8：129102060129109035反链的表达，发现存在差异性表达。近年来，越来越多的研究揭示lncRNAs在新生血管发生中的作用。我们既往的研究发现在ROP小鼠模型中和糖尿病诱导的微血管模型中，lncRNAs出现异常的表达。。。LncRNA—MALATl可以导致周细胞的丢失，毛细血管变性，微血管渗漏，视网膜血管感染。此外，在体外，该基因敲除后可以调控内皮细胞的增殖，移行和管径的形成”。另一项研究表明，体外MALATl的缺失影响内皮细胞由增殖到移行表型的平衡，技巧从一个增殖迁移的内皮细胞表型，其基因缺失或药理抑制减少体内血管生长”。敲除调控AngII的lncRNA，lnc—an9362，给以影响血管平滑肌细胞的增殖，提示对该lncRNA的检测，有助于对血管紧张素II相关的心血管疾病的诊断”。1ncRNAMVIH在肿瘤组织中表达上调，且与肝癌微血管浸润具有一定的相关性”。在我们的这个研究中，失调的lncRNAs参与了CN的病理进程。总的来说，对IncRNA参与调控基因表达的作用机制的研究将无疑会改变我们对病理性新生血管的复杂调控网络的认识。与mRNA相比，incRNAs具有较低的生物保守性23。因此，很难仅仅根据碱基序列预测他们的生物学作用。为了揭示lncRNAs在CN发生中潜在机制，我们对IncRNA／mRNA的相关性做了研究，GO富集分析显示CN的生物学行为发生在细胞外区，与DNA结合并发生免疫反应。在病理性新生血管形成中，细胞外基质重塑的调节存在基质沉积和降解的局部变化，从而改变细胞生长，迁移和分万方数据 南京医科大学博士学位论文化“。DNA结合能力的调控可能会直接改变基因的表达模式，这也可能会影响细胞周期的调控过程，凋亡和血管生成。眼部的免疫反应的变化会影响其正常的免疫赦免状态2瓢”。基于上述证据，可以推断，lncRNAs相关mRNA可能参与CN的调控。信号通路的研究可以让我们了解基因组本身及其与生物系统相互关系。我们发现lncRNAs共表达mRNA多富集于“癌症”的信号通道，这和一些信号通道，如VEGF，JAK一2／STAT3，Wnt，p53，PPAR，BTGF一13信号通路有关。大量的研究表明，信号通道可以调控肿瘤新生血管，包括其发生，进展和转移27-290病理性新生血管的发生通常都有相似的分子生物学发病机理，我们推测一些lncRNAs可能直接作用于某些信号通道，从而对新生血管的发生产生影响。动物实验可以帮助我们了解人类疾病的发病机制。这里，我们确定了小鼠CN相关的lncRNAs。为了揭示其潜在的临床意义，我们还研究了是否他们的人类同源基因在化学烧伤、角膜炎所致的血管化角膜中存在差异表达。我们发现人类同源NR033585在血管化角膜中明显上调，与之相反，人同源1incRNA：chr8：129102060—129109035反链则明显下调。人同源NR一033585有与促血管生成因子如VEGF，MMP一9，andAng一2，相似的表达模式。相反，人类同源lincRNA：chr8：129102060-129109035反链则具有与抗血管生成因子如PDGF相似的作用301”。由此，可以推测，这些1ncRNAs在病理性CN的发生中起着促进或拮抗的作用。CN与眼表炎症或感染性疾病有关，威胁视力。这是一个复杂的过程，一些基因产物参与其中。本实验中，证据表明lncRNAs可能对CN发病机制起到调节作用，对转录调控的补充，改变了促血管生成因子和抗血管生成的因子之间的平衡。此外，一些lncRNAs有可能发展为眼部新生血管性疾病的治疗靶点。在今后的研究中，需要更多的研究来确定incRNAs在新生血管形成中的作用，对lncRNAs的干预可能成为眼部新生血管性疾病的新的治疗策略。万方数据 南京医科大学博士学位论文第二部分NR一033585对人脐静脉内皮细胞功能的影响材料和方法1材料1．1细胞株人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)细胞株由美国普洛维斯顿学院病生系万寅生教授实验室提供。1．2主要实验仪器二氧化碳培养箱美国Thermo公司实时荧光定量PCR仪美国Thermo公司台式低温高速离心机美国Thermo公司MK3酶标仪美国Thermo公司低温冰箱(一80。C)美国Thermo公司垂直电泳仪美国Bio—Rad公司细胞培养瓶25cm2。Nunclon公司细胞培养板96孔，Nunclon公司细胞培养板24孔，Nunclon公司透射电子显微镜荷兰Philips公司PH仪Beckman公司电子分析天平AE一100，METTLER磁力搅拌器英国Jenway公司倒置显微镜日本Olympus公司荧光显微镜日本Olympus公司制冰机日本SANYO公司AC2．4El生物安全柜新加坡ESCO公司万方数据 1．4主要实验试剂DMEM／F12美国Gibco公司青霉素／链霉素(1：100)美国Sigma公司胎牛血清(FBS)美国Gibco公司0．25％胰蛋白酶美国Gibco公司Tween-20美国Sigma公司右旋葡萄糖(D．Glucose)美国Sigma公司PBS美国Sigma公司BSA美国Biosharp公司MTT美国Biosharp公司BCAProteinAssayReagentKit美国Pierce公司SiRNA上海GenePharma公司Lipofectamine2000美国Invitrogen公司Calcein．AM美国MolecularProbes公司PI美国MolecularProbes公司Ki67英国Abeam公司羊抗兔二抗美国Invitrogen公司DAPI美国Sigma公司1NF．美国LifeTechnologies公司27万方数据 南京医科人学博士学位论文其他试剂均为国产分析纯，PBS及PBS．T缓冲液，H202稀释液等常规配置见《分子克隆》。2．实验方法2．1细胞培养2．1．1细胞复苏：1)将冻存细胞从液氮中取出，立即放入37℃水浴锅内，轻轻摇动冷冻管，使其在一分钟内全部融化(不宜超过3mins)。2)解冻后，将细胞直接接种到含完全培养液(10％FBS，1％青链霉素的DMEM／F12培养基)的培养瓶巾于37℃、5％C02培养箱内进行培养。3)24小时后，再用新鲜完全培养液替换培养液，以除去DMS0。2．1．2细胞传代：1)吸光培养瓶中的培养液，加入l、2ml0．25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个培养瓶为准)静置2、10mins(显微镜下动态监测)。2)吸取胰蛋白酶液，加入培养液。用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打贴壁细胞直至细胞完全从瓶底脱落，形成细胞悬液。3)加适量新鲜培养液到细胞悬液，混匀后根据实验需要分装入新的培养瓶中。在显微镜下观察密度，细胞计数。标记传代时间及细胞株代数，放入37℃、5％C02培养箱培养。2．1．3细胞铺板：1)取对数生长期细胞按上述方式消化。2)在显微镜下进行细胞计数，根据实验分组需要、密度要求将细胞均匀接种于培养皿或是各个孔皿内。完成标记后，于37℃、5％C02培养箱内进行培养。2．1．4细胞冻存：1)预先配置冻存液：含20％血清培养基，10％DMSO。2)取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞万方数据 南京医科大学博士学位论文悬液。3)取lml细胞于冻存管中，密封后标记细胞名称和冷冻日期。4)冷冻过程：或使用程序降温盒，每秒降温1℃。2．1．5细胞培养基的配置：1)正常培养基：lO％胎牛血清的DMEN培养液中含lOOU／ml青霉素、100g／ml链霉素。2)H。0：培养：取8．3ul的30％HzO。，加入到lml无菌双蒸水中，所得液体浓度为80mmol／L，根据实验条件进行调整使用体积。2．2siRNA转染沉默目的基因1)转染的前一天，胰蛋酶消化细胞，加入培养基吹打细胞，将均匀的单细胞悬液种入预先润号的24孔板，每孔接种细胞数为2×104个。加入IO％FBS的完全培养液至总体积为250ul，轻轻混匀，放入37。C，5％C02培养箱中生长至70％’80％。2)换成0．5％FBS的DMEM饥饿细胞，12h后换成新鲜的0．5％FBS的DMEM培养液。3)准备转染试剂：在一洁净无菌的离心管内加入适量不含抗生素和谷氨酰胺的DMEM溶液，每lOul的lipotap约转载1．6ug的siRNA，室温(15—25"C)孵育。4)15min后，将lipotap—siRNA复合物加入培养液中，轻轻混匀，细胞培养8h后，去除含有1ipotap—siRNA的培养液，每孔加250ul的新鲜培养液，继续培养。2．3PI染色法万方数据 南京医科大学博士学位论文钙黄绿色-AM(Calcein—AM)的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可以透过细胞膜，能对活细胞染色。碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)是一种可对细胞核DNA染色的荧光染料，其用于细胞凋亡的检测试验。PI不能通过活细胞膜，却可以通过破损的细胞膜进入细胞核形成PI—DNA复合体。将10。50uMPI粉末溶于PBS，配置成溶液。以1／10LLf歹,I将PI溶液加入含细胞的培养基内，在37℃孵育20分钟。用PBS洗涤细胞两次。在荧光显微镜下观察细胞(激发波长为535nm，发射波长为615nm)。镜下观察拍照，细胞计数分析。2．4JC—l染色jc一1为一种可在线粒体内聚集的阳离子染料，被用于检测早期凋亡的发生。JC-1在线粒体内低浓度时以单体形式存在，发射光主要为绿光(、525nm)；高浓度是形成多聚体，发射光主要为红光(、590nm)。当线粒体状态良好时对jc一1摄取量少，所以在线粒体内jc一1以单体形式存在，绿光／红光比值高。凋亡早期，线粒体发生去极化，线粒体内JCl浓度升高，其就以多聚体形式存在，绿光／红光比值降低。JC一1染色的绿光／红光比值取决于线粒体膜电势，与线粒体的形态、体积和密度无关，因此更好反映线粒体状态。JC一1也因此可检测细胞早期凋亡。将jc一1用DMSO配置成1"5mg／ml的存储液，在一20℃保存。用时用培养液稀释至10ug／ml终浓度。弃去己贴壁细胞的培养基，洗涤细胞后直接加入配置好的染色液。lO、30分钟后在荧光显微镜下观察。线粒体状态良好的细胞显示绿色为主。当红色信号增强时，红绿叠加呈橙黄色。线粒体状态不佳时为红色。2．5Hoechst33342染色Hoechst能穿过活细胞膜与细胞核结合(主要是凋亡活细胞)，在紫外光激发下将核着色为蓝色。1)取普通盖玻片于70％乙醇浸泡5分钟以上，在超净台内风干或用PS洗涤3万方数据 南京医科大学博士学位论文次，再用细胞培养液洗涤1次。将盖玻片置于6孔板内，植入细胞培养过夜，使约50’80％密度。2)加入凋亡刺激后，弃去培养液，加入0．5ml的固定液。常温固定10分钟以上，4℃固定过夜。3)弃去固定液后用PBS洗涤置于摇床3分钟，共2次。4)加入0．5mlHoechst染色液，置于摇床染色5分钟。5)用PBS洗涤3分钟，共2次。6)滴l滴抗荧光淬灭封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片封片。荧光显微镜拍照采集实验数据(激发波长为350nm，发射波长为461nm)2．6K167检测HCEC细胞的增殖1)选取对数生长期的细胞，加入胰酶消化，之后将细胞接种于24孑L培养板中，总接种细胞数控制在5×104个左右，方法同前。每孔加2ml含10％热灭活FBS、1％青链霉素的DMEM培养液。培养箱培养24小时后更换无血清培养基进行饥饿处理12小时。2)终止培养后，弃掉旧培养基，加PBS洗涤2次，弃掉，加4％多聚甲醛固定25min，75姗01／LNH4CL和20mmol／LGlycine灭活lOmin．加PBS洗涤2次，5％BSA室温封闭30min，加抗K167兔源多克隆抗体(1：300)，4"C温箱孵育12h，PBS漂洗lOminX3次，荧光山羊抗兔IgG室温孵育2h，PBS漂洗lOmin×3次。采用荧光显微镜拍照采集实验数据。2．7细胞荧光1)PBS缓冲液洗细胞2×5min。2)4％多聚甲醛固定25min，PBS缓冲液洗3x5min。3)1．5％Tritox-100+2．5％BSA混合液透膜、封闭40min。4)加Ki67一抗，低度为l：300，CC过夜。5)室温复温lh，PBS—T缓冲液洗3×5min。6)孵二抗，I：1000，常温孵育2h后，显微镜下观察。万方数据 南京医科大学博士学位论文3试验分组1)空白对照组：无FBS的培养基中不加H20：，置于37℃、5％C02的细胞培养箱中培养60min，设置4个平行复孔。2)H20。组：向培养板孔中加预先配制好的H：0：溶液，计算加入母液体积，使终浓度为200umol／I．，置于37℃、5％C02的细胞培养箱中培养48后终止培养，每组设置4个平行复孔。3)H20：+ScrsiRNA组：在用H20：处理之前先加入转染试剂沉默不相关基因做阴性对照，之后再按照H20。组培养，设置4个平行复孔。4)H20：+NR一033585siRNA组：在用H20。处理之前先加入NR一033585siRNA转染试剂沉默，之后再按照H20。组培养，设置4个平行复孔。4统计学处理实验所得统计数据均以均数4-标准差(mean4-SD)表示，采用SPSSV13．0软件进行统计学分析。两组之间比较应用Student、St双侧检验，多组之间比较运用ANOVA(one—wayanalysisofvariance，单因素方差分析法)，P