毒性试验方法

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1、实验步骤：1.制作光密度与藻浓度关系的工作曲线在本次实验中，从实验的条件和实验的准确性出发，我们选择了通过建立吸光度与藻细胞浓度的关系式来确定藻细胞浓度的方法。实验方法(参照水生生物实验标准方法)：将收获的的藻液离心(12000rpm，10rain)去上清液，用0．5％NaCI溶液清洗细胞3次后，然后分别稀释成不同浓度，分别准确吸取O．1ml藻液，置于浮游植物计数框或血球计数框内，在显微镜下计数，并至少计数2片，取其平均值。但每片的细胞数与平均值之间的差应小于±15％，否则须继续取样计数，再取平均值。同时用lena比色皿在650nm的吸收波长下测定不同试验浓度组藻液的光密度。然后以光密度

2、值作为自变量，藻液中细胞数作为因变量进行线形拟合，这样就可以建立藻液光密度和细胞数的工作曲线关系如下：藻细胞浓度与吸光度之间的关系曲线经过实验得到细胞浓度与吸光度的关系为y=4E+06x～28940(R2=0．9969)。根据这个关系式在以后的实验中就可以通过测量藻液的吸光度来确定藻的浓度。1.重金属对藻的毒性研究实验方法：250ml锥形瓶中加入营养盐，然后向其中加入一定量的重金属，最后再加入培养好的藻液20ml，使混合液的体积为100ml，并保证藻初始浓度为2×104个／ml左右，重会属的浓度为等对数问距递增，并且做一空白样。这时测定其原始吸光度以确定藻的原始浓度。用棉塞塞好锥形瓶盖口

3、，放入光照培养箱里培养，光暗比设定为12h：12h，温度2l℃，光照强度为3000Lx，在水浴恒温震荡器中每天震荡2次，一次30分钟，以保证藻液更均匀的混合，有利与其生长。在96h测定藻液的吸光度的值。根据吸光度值由图1所得的公y=4E+06x-28940p-J"以计算出此时的藻液浓度。根据公式分别计算出各瓶藻液的抑制率，所用公式如下：其中：v(t)为藻细胞的增长速度；Nt为当时间为t时刻的藻细胞浓度；N0为藻细胞的初始浓度；t为藻细胞的培养时间；Vn为空白样中藻细胞的增长速度：I为藻细胞的抑制率；（1）96h-EC50的单一毒性研究在藻液培养96小时后，取出锥形瓶并在水震荡器上摇匀，使

4、罩面的藻液混合均匀，然后使用lcm的比色皿，在波长为650nm的条件下分别测定光密度，然后根据所得关系式y=4E+06x-28940tt算出浓度、再由公式3-5、3-6计算出抑制率，由所得数据可知四种重金属的半数有效浓度大小和毒性的大小顺序（2）96h-EC50的联合毒性研究联合毒性评价方法加和指数(AI)法(Additionalindex)相加指数法又称为相加指数法。Lloyd(1961)在定量Cu和zn对虹鳟鱼的联合效应时使用了这一概念。并得到了Marking[舯1(1977)的系统描述。Muska和Webber(1977)在研究cu—Ni对网纹花鳞鱼(Poeciliareticul

5、ata)的联合效应时，发现其浓度加和模型可用来预测其致死和亚致死反应。后来，又得到修瑞琴等(1994)的推广。根据单一实验和联合实验的结果，分别得到Lc50或EC50后，按下式先求出M，式中，肘表示毒性相加作用之和；A1、BI、Cl、⋯分别表示毒物A、B、C、⋯的毒性LC50或EC50值；Am、Bm、Cm…分别表示混合物毒性中各毒物A、B，C、⋯的毒性LC50或EC50。并用下式表示计算相加指数。如果试验结果表明，AI=0，那么i个化学物质之间呈简单加合作用；AI>0，i个化学污染物质之间呈协同作用；A1<0，i个化学污染物质之间呈拮抗作用。等浓度配比时的毒性研究实验方法：向250ml锥

6、形瓶中加入营养盐，然后向其中加入一定量的两种重金属，最后再加入培养好的藻液20ml，使混合液的体积为100ml，并保证藻初始浓度为2×104个／ml左右，重金属的浓度为等对数间距递增，最终溶液中两种重金属的浓度相等，并做空白样。这时测定其原始吸光度以确定藻的原始浓度。用棉塞塞好锥形瓶盖口，放入光照培养箱旱培养，光暗比设定为12h：12h，温度2l℃，光照强度为3000Lx，在水浴恒温震荡器中每天震荡2次，一次30分钟，以保证藻液更均匀的混合。并在96h测定藻液的吸光度的值。根据吸光度值由公式y=4E+06x一28940可以计算出此时的藻液浓度。并建立浓度与几率单位之问的关系，当几率单位为

7、0．5时，得到混合溶液的Ec50。96小时等浓度配比在藻液培养96小时后，取出锥形瓶并在水震荡器上摇匀，使罩面的藻液混合均匀，然后使用Icm的比色皿，在波长为650nm的条件下分别测定光密度，然后根据所得关系式y=4E+06x-28940计算出浓度，对比空白样中藻的浓度，由公式3-5，3—6计算出抑制率。