基因毒性试验基因毒性试验

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基因毒性試驗基因毒性試驗(毒性試驗規範)¢目的:偵測化合物直接或間接引發之基因傷害與程度¢基因突變,廣泛性的染色體缺失或重組,或染色體數量改變等基因損害皆可能會導致遺傳疾病或體細胞之變性.¢試驗物質會導致上述傷害,則該產品可能為人體致癌物或致突變原,可能會導致癌症或遺傳缺陷¢基因毒性試驗有助於預測試驗物質的致癌性,且有助於致癌性試驗的結果分析¢基因毒性試驗可分為活體與體外測試,測試指標包括基因突變,染色體變異或基因損害等1 基因毒性測試方法（毒性試驗規範）參考指標測試方法基因突變1.Genemutationtestwithbacteria2.Genemutationtestwithmammaliancellsinculture3.TestwithDrosophilamelanogaster4.Spottestwithmice5.Specificlocustestwithmice染色體變異1.Chromosomalaberrationtestwithmammaliancellsinculture2.Chromosomalaberrationtestwithbonemarrowcellsorrodents3.micronucleustestwithrodents4.Chromosomalaberrationtestwithgenotypesofrodents5.Dominantlethaltestwithrodent6.Reciprocaltranslocationtestwithmice基因受損1.Phageinductiontestwithbacteria2.DNArepairtestwithbacteria3.UnscheduledDNAsynthesistest(UDS)withmammaliancells4.Sisterchromatidexchange(SCE)testwithmammaliancells其他測試1.Mitoticrecombinationandgeneconversiontestwithyeast2.Spermabnormalitytest綜合基因毒性試驗（毒性試驗規範）測試項目測試方法微生物突變分析1.細菌基因突變測試法（Amestest）體外哺乳類細胞遺傳毒1.體外哺乳類細胞的染色體異常分析性分析法(Invitrochromosomalaberrationtestwithmammaliancellsinculture)2.體外鼷鼠淋巴瘤tk分析法(Invitromouselymphomatkassay)動物活體基因毒性分析1.囓齒類骨髓細胞染色體異常測試法(Chromosomalaberrationsinbonemarrowcellsofrodents)2.囓齒類骨髓細胞之微核測試法(Micronucleiinbonemarrowcellsofrodents)3.囓齒類周邊血液之微核測試法(Micronucleiinperipheralbloodofrodents)2 OfficeofFoodAdditiveSafetyRedbook2000ToxicologicalPrinciplesfortheSafetyAssessmentofFoodIngredientsJuly7,2000Short-TermTestsforGeneticToxicityGeneticchangesknowntobeassociatedwithadversehumanhealtheffectsincludegenemutations,chromosomalrearrangementsordeletions,andlossorgainofwholechromosomes(aneuploidy染色體不正常)orchromosomalsegments.Genotoxicitytestsareinvitroandinvivotestsdesignedtodetectcompoundsthatinducegeneticdamage.3 RecommendedTests1.Atestforgenemutationsinbacteria2.Aninvitrotestwithcytogeneticevaluationofchromosomaldamageusingmammaliancellsoraninvitromouselymphomathymidinekinase+/-genemutationassay3.Aninvivotestforchromosomaldamageusingmammalianhematopoieticcells.¢Themutationassaysspecifiedinthestandardbatteryarecapableofdetectingdifferentspectraofgeneticdamage.–Thetestsforgenemutationsinbacteriadetectpointmutationswhichinvolvesubstitution,addition,ordeletionofoneorafewDNAbasepairs.–Pointmutationsmayalsobedetectedininvitromammaliancellmutagenicityassays.Themouselymphomatk+/-assayspecifiedinthebatteryalsodetectslargedeletions,translocations,mitoticrecombination/geneconversionandaneuploidyinadditiontopointmutations,makingthistheassaywiththebroadestspectrumofdetectablegeneticdamageinthebattery.4 MouseLymphomaThymidineKinaseGeneMutationAssayAninvitromammaliancellgenemutationtestcanbeusedtodetectgenealterationsinducedbychemicalsubstances.Whilethereareanumberofcelllinesthatcanbeused,theL5178YTK+/--3.7.2Cmouselymphomacelllineusingthethymidinekinase(TK)geneisthecelllineandassayofchoice.Theassaydetectsmutationsknowntobeimportantintheetiologyofcancerandotherhumangeneticallymediatedillnesses.Thereisevidencethattheassaydetectsgenemutations(pointmutations)andchromosomalevents(deletions,translocations,mitoticrecombination/geneconversionandaneuploidy).Theefficiencyofdetectionofallofthesemutationaleventsisstillunderinvestigation.¢OtherinvitromammaliangenemutationassaysexistincludingthosethatuseeitherChinesehamstercelllines(CHO,AS52,andV79)orhumanlymphoblastoidcells(TK6).Inthesecelllinesthemostcommonlyusedgeneticendpointsmeasuremutationateitherthehypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase(HPRT),atransgeneofxanthineguaninephosphoribosyltransferase(XPRT),orTK.TheTK,HPRTandXPRTmutationtestsdetectdifferentspectraofgeneticevents.TheautosomallocationofTKallowsforthedetectionofgeneticeventsthatarenotdetectedattheHPRTlocusontheXchromosome5 細胞基因突變分析將細胞(tk+/-)先以測試樣品處理，然後再經篩選藥物的篩選，如此，只有突變細胞(tk-/-)可形成菌落。經由觀察細胞群落生成數目的多寡，即可判斷受測試物質致突變能力的強弱。同時，經由細胞群落的大小，也可以區分出來各種不同形態的遺傳物質改變的細胞。PrincipleoftheTestMethodCellsdeficientinthymidinekinase(TK)duetothemutationTK+/-toTK-/-areresistanttothecytostaticeffectsofthepyrimidineanaloguetrifluorothymidine(TFT).TK+/-cellsaresensitivetoTFT,whichcausestheinhibitionofcellularmetabolismandhaltsfurthercelldivision.Thus,mutantcellsareabletoproliferateinthepresenceofTFT,whereasnormalcells,whichcontaintheTKenzyme,arenot.6 細胞基因突變分析（一）原理：1.TK(TK6,L5178Y)--trifluorothymidine敏感TK+/-TK-/-2.HPRT(V79)--6-thioguanine敏感HPRT+HPRT-在哺乳類細胞中，有兩段基因常被用來作為研究對象，一是與purinesalvagepathway所需的酵素hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase有關的hgprt基因。另一段則是與thymidinekinase的作用有關的tk基因。二者在致變異實驗的結果上，並無明顯的差異。因為以tk基因進行實驗時，其expresstime較短，故以tk基因進行致變異試驗。7 細胞基因突變分析（二）folicacidreductase嘌呤、嘧定合成主要途徑aminopterinXTK+新合成嘧定合成次要途徑thymidinekinase的DNAHPRT+嘌呤合成次要途徑hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferasePreparationofTargetCells¢L5178Ycellswillbeculturedfor24hoursinthepresenceofthymidine,hypoxanthine,methotrexateandglycinetopoisontheTK-/-cells¢.經由要藥物(CHAT)溶液篩選後得到的tk+/-細胞，須再經CHT溶液處理，讓細胞恢復正常的生長，然後再逐漸地置換掉CHT溶液，此時，細胞才可用於下一步驟的藥物處理。8 細胞基因突變分析（二）L5178YTK+/-↓CHAT自發性突變株去除↓↓Treatedwithmutagen(-S9)Treatedwithmutagen(+S9)+Sample↓↓ResuspendedingrowthResuspendedingrowthmediumfor72hoursmediumfor72hours↓↓↓↓PlatedatlowPlatedathighPlatedatlowPlatedathighdensityw/ndensitywithdensityw/ndensitywithselectiveagentselectiveagentselectiveagentselectiveagent↓↓↓↓+篩選試劑P.E.C.E.P.E.C.E.(TFT)↓↓↓↓M.F.M.F.9 ¢篩選試劑的作用，主要是讓tk-/-細胞能夠長出細胞群落，而tk+/-細胞則不能。在篩選試劑的選擇上，6-thioguanine(6-TG)、ouabain(OUA)和trifluorothymidine(TFT)等，因為具有對特殊細胞的專一性，所以最普遍。通常，我們以trifluorothymidine(TFT)來篩選tk-/-突變株的生成。¢tk基因所引起的突變可分為兩類：–十天時觀察所得的normalgrowthmutants(NG)•Normalgrowthtk-/-mutants可能是由鹼基對被取代、frameshift、或是基因序列的插入或缺失所引起–二十天時觀察所得的slowgrowthmutants(SG)。•slowgrowthtk-/-mutants則是因為整段tk基因的改變造成，可能是經由基因conversion/recombination的機制而造成整段DNA的被刪除。10 以此方法來測試致變異研究時，須注意有偽陽性及偽陰性結果的出現。偽陽性結果是測試樣品本身並不具有致突變性，但是由於測試時pH,osmolality的改變，或是因為樣品本身毒性極高而造成。偽陰性結果的發生，則是因為樣品作用機制的不同，導致的致變異效應，不能由使用的測試方法所測得，故即使樣品本身是致癌物，但仍得到負結果。這些問題，是實驗者在從事測試時應注意的。11 ¢ThisprotocolhasbeenwrittentocomplywithOECDGuidelinefortheTestingofChemicals,Guideline476(InVitroMammalianCellGeneMutationTest),July1997。1991年Scott等人已經探討過細胞的基因毒性包括pH值。在動物實驗暴露酸霧滴的基因作用和有關效應目前尚無詳細資料可以利用，然而pH值減少引起的效應已經被探討了。1983年SingerandGrunberger等人發現低的pH值會增加萃取DNA的去嘌呤化程度(depurination)，1986年Brusick等人發現極端的pH值將會減少DNA複製與酵素修補作用時的精確度。但低的pH值並不會影響鼠傷寒桿菌(Salmonellatyphimurium)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、Neurosporacrassa或酵母菌(Saccharomycescerevisiae)點突變的頻率，可是會使酵母菌產生基因倒轉(conversion)，蠶豆(Viciafaba)根尖發生染色體缺失和曾受低pH值環境處理的海膽精蟲產下之胎兒與後代會有異常的有絲分裂發生。在哺乳動物的研究發現，低pH值狀況下似乎僅在有S9基因者會增加基因毒性效應。1986年Brusick等人發現只有在含有S9的中國倉鼠卵巢細胞暴露在低pH值之下會導致染色體缺失，然而Morita等(1989)發現在相同的細胞不含S9，低pH值(5.5或更低)之下亦有染色體缺失的現象，但含S9會增加此效應。在pH值為5.1下大鼠(rat)淋巴球的培養不管有沒有S9都沒有染色體異常。在小鼠(mouse)淋巴球L5178Y細胞發現暴露低pH值不管有沒有S9都會導致染色體突變。12 染色體突變有絲分裂(mitosis)MitosisInterphase細胞週期13 染色體玻片製作加入秋水仙素於有絲分裂中加入低張溶期之圓亮細胞加入固定液(0.075M液:甲醇/細胞分散於玻片(抑制紡綞絲KCl)後細胞冰醋酸上，細胞脹破，形成)膨脹mixture染色體散佈開來染色體玻片染色方法SimplestainG-bandingC-bandingQ-banding14 染色體異常分析測試項目形成原因測試系統分析方法染色體結構變異染色體斷裂,1.體內測試：1.收集藥物處理(Chromosomal缺失或重組lymphocyte後之分裂細胞aberration,CA)2.體外測試：哺乳類細2.製作染色體玻胞株片3.Giemsastain姊妹染色分體染色體斷裂1.體內測試：1.收集藥物處理交換與修復lymphocyte後之分裂細胞2.體外測試：哺乳類細2.製作染色體玻(Sisterchromatid胞株片exchange,SCE)3.differentialstain微核測試染色體斷裂,1.體內測試：bone1.收集藥物處理(Micronucleustest,或紡錘絲損壞marroworperipheral後之細胞MN）bood2.直接抹片後觀2.體外測試：哺乳類細察胞株3.acridineorangestain測試系統（染色體變異與姊妹染色分體交換)測試細胞-lymphocyte-Chinesehamsterovarycell(CHO),Chinesehamsterlung(V79)(優點︰分裂時間短/染色體大但數目少/穩定之染色體核型）-qualitycontrol:*Colony–formingefficiency:50-100%*Spontaneousmutationfrequency:0-20x10-6劑量範圍最高劑量：50﹪細胞抑制濃度（收集足夠之分裂細胞）採樣時間染色體變異：藥物處理後第一次有絲分裂期（M1）姊妹染色分體交換：藥物處理後第二次有絲分裂期（M2）Background染色體變異：<1%,姊妹染色分體交換：<15SCE/cellfrequencyPositiveDirectacting(noactivationneeded)control-ethylmethanesulfonate(EMS),mitomycinPromutagen(requiringactivation):cyclophosphamide15 染色體變異（chromosomalaberration）¢測試項目：染色體結構之變異–結構變異：deletion,duplication,inversion,translocation–一般毒性測試主要觀察缺失（deletion）與交換（exchange）¢形成原因:–DNA發生中斷(discontinuities)或斷裂(break)造成，若斷裂無法再結合(reunion)，則會造成缺失(deletion)，而錯誤之再結合則造成交換(exchange)¢種類–染色體型（chromosome-type﹚:兩股染色分體皆發生變異–染色分體型（chromatid-type﹚:只有一股染色分體有變異染色體型結構變異Centricringdicentric16 染色體分型結構變異quadriradialsbreak實驗步驟¢接種細胞Æ加入測試物質Æ培養至適當時機（如CHO/V79cells,8-12h)Æ加入紡錘絲抑製劑（如秋水仙素，colcemid）收集第一次有絲分裂細胞Æ製作染色體玻片ÆGiemsastain¢資料分析（毒性試驗規範）︰–於顯微鏡下觀察染色體數目與形態–每個劑量組製備2片，每片至少觀察100個分裂中期細胞–在描述細胞形態異常時，需註明染色體或染色分體之結構變異種類。–試驗結果以表格方式描述染色體變異之種類與數量，並計算含染色體結構變異細胞之頻率17 姊妹染色分體交換（sisterchromatidexchange，SCE）¢染色體於細胞分裂時複製為兩條染色分體（chromatid），此兩條染色分體互成為姊妹染色分體¢姊妹染色分體交換–發生於DNA複製期間–姊妹染色分體在相同位置互相交換遺傳物質–不會造成結構改變，需用differentialstaining分辨姊妹染色分體–發生機制可能與DNA斷裂與再接合（breakandreunion）有關（分子機制仍不明）–用於毒性試驗：一些具突變性或致癌性化學物質會提高SCE頻率Differentialstaining--分辨姊妹染色分體¢步驟：–於培養基中加入DNA鹼基類似物bromodeoxyuridine（簡稱BrdU），DNA複製過程中會以BrdU取代thymidine，放入新合成的DNA中，細胞經過兩次分裂後，姊妹染色分體之BrdU取代程度不同，以螢光染料Hoechst33258與Giemsa染色後（Fluorescence-plus-Giemsa），則會使兩條姊妹染色分體顏色深淺不同，同時亦可看出二者間是否有有交換產生18 Differentialstaining--分辨姊妹染色分體¢原理：–Hoechst33258螢光染劑：結合在DNA之A-Tbase–BrdU-DNA：•Hoechst33258螢光染劑無法結合-->螢光減弱•對光線不穩定-->以UV照射分解之•elutedbyhotsaltsolution(65°C,2XSSC)•Giemsa染色較淡（或螢光減弱）–收集第二次分裂之細胞（M2）BATAABABATABATFirstDivisionGCGCSecondDivisionCGCGCGCGCGinBrdU(B)ATABinBrdU(B)BATABABATABATAABABATABATCGCGGCGCGCGCGCATABBATABABATAOriginalDNAMetaphasechromosomeMetaphasechromosomehelixunifilarlysubstitutedbifilarlysubstitutedABATABABCGCGCGCGSecondDivisionBABATABAinBrdU(B)withanATABABABGCGCGCGCexchangeatthecentromereBABABATASCEsareseenassharpdemarcationsinthestainingpattern19 實驗步驟¢接種細胞Æ加入測試物質與BrdUÆ培養至適當時機（如CHO/V79cells,20-24h)Æ加入紡錘絲抑製劑（如秋水仙素，colcemid）收集第二次有絲分裂細胞Æ製作染色體玻片Ædifferentialstain¢Differentialstain:–Hoechststain(0.5ug/ml)for15-30minÆwashÆUV(365nm)at10-15cmfor2-2.5h(variable)ÆwashÆ55-65°C2XSSCfor30minÆ3%Giemsastain5-10min姊妹染色分體交換資料分析NORMAL1.觀察50個以上M2分裂細胞2.SCE/cellorSCE/chromosome3.與陰性對照組比較harlequinchromosome(SCE)20 微核測試（micronucleustest）一般受試物質只需要進行一項動物活體基因毒性試驗，囓齒類骨髓細胞微核試驗法或染色體異常試驗法，由於微核試驗法較為敏感，所以是國際間測試毒藥物誘發染色體變異方法中最常用的體內測試方法。實驗動物一般選用小鼠，如因受試物質的性質而需加做28天基因毒性試驗，則選用大鼠或倉鼠。¢微核試驗是用來測量周邊血或骨髓中血球細胞發生微核事件頻率的技術。血球細胞中以紅血球為微核試驗的最佳樣品，因為紅血球在生成過程中丟失細胞核後，形成網織紅血球（RET），並在三天內成為成熟紅血球。網織紅血球與成熟紅血球因其胞漿內只殘留少量的核酸物質，便提供一相對低背景值，故這些細胞便帶有微核，因富含核酸物質，很容易可以核酸特異性染劑來辨識。21 骨髓(bonemarrow)是製造紅血球的場所(特別是紅骨髓)。當紅血球分化完成之後，這些細胞就會開始製造血紅素，但是最後會失掉它們的細胞核以及裡面的胞器。骨髓內較年輕的紅血球仍然保有一些核糖體，所以看起來好像有網狀結構一般，如果利用特殊的染色，可以把這些網狀結構染出來，所以這些細胞就叫做網狀球(reticuocyte)。在正常情況下，只有成熟的紅血球(已經完全失去核糖體)才會離開骨髓，進入血液循環內。但是如果紅血球不正常地大量製造，在血液中就可以找到很多網狀球。紅血球之生長分化過程骨髓周邊血液120天60-70小時3-10小時10-33小時2天最後一次有絲分裂排除細胞核母細胞正染性紅多染性紅血網狀紅血球成熟紅時期血球母細球（PCE）（RET）血球胞染色體斷裂微核形成可計數微核之細胞期可計數微核之細胞期藥物誘變處理22 微核實際上是紡錘體著絲點功能障礙形成的整條染色體或染色體的斷片，從微核形成機制來說，它主要是來源於有絲分裂後期的無著絲點斷片，因無紡錘絲牽拉而游離於子細胞漿中。因此微核率和染色體變異有很好的相關性。試驗方法是先以受試物灌胃餵食小鼠兩次，間隔不超過24小時，第2次餵食後36-72小時間取樣尾靜脈血，製備血液抹片。如欲分析骨髓，則可第2次餵食後6小時間處死小鼠，收集2個股骨內之骨髓，並製備骨髓液抹片。爾後分析抹片中之網狀紅血球(reticulocytes)，每隻動物至少觀察1000個網狀紅血球，記錄微核發生的數目，同時計算網狀紅血球佔全部紅血球的比例。如微核細胞大於對照組則為陽性反應。23 微核測試（micronucleustest）¢微核︰–細胞質之染色小體，源自於細胞分裂後未包含於細胞核之染色體或無著絲點片段(fragment)–細胞分裂末期以後，單獨形成一個或數個規之次核，被包含於子細胞之細胞質而形成，由於比細胞核小，所以稱為微核–形狀、構造與染色性質與細胞核類似¢形成機制︰–染色體發生斷裂或染色體移動延遲（lagging）（紡錘絲損害或其他抑制有絲分裂之機制）¢用途︰–偵測染色體斷裂或染色體數目異常¢測試細胞︰–完成細胞分裂之細胞測試系統¢微核測試之優缺點–優點:簡便與靈敏，不受細胞週期限制，操作與計數方法簡單–缺點:無法偵測不會引起染色體斷裂或染色體延遲現象之化學物質¢動物試驗–觀察目標（紅血球系列細胞）︰•骨髓之多染性紅血球細胞（polychromaticerythrocyte,PCE）•周邊血液之網狀紅血球細胞（reticulocyte,RET）¢體外測試•Lymphocyte/哺乳類細胞株•區別分裂細胞︰於試驗末期，加入細胞質分裂抑制劑（cytokinesisinhibitor），例如cytochalasinB(CytB)，使分裂細胞之細胞質不分離而細胞核分離24 網狀紅血球細胞實驗操作¢動物試驗–藥物處理Æ24-48hÆ處死動物Æ收集骨髓細胞Æ製作抹片Æ染色觀察–藥物處理Æ24-48hÆ收集周邊血液Æ製作抹片Æ染色觀察¢體外測試︰–藥物處理Æ24-48hÆ加入cytochalasinBÆ製作細胞抹片Æ染色觀察¢染色方法–Giemsastain:•PCE/RET:灰藍色，微核︰深紅或深藍色–Acridineorganestain（螢光染色）:•PCE/RET︰橘紅色，微核︰黃綠色25 測試結果微核(micronucleus)RBC微核RET體外測試︰以cytochalasin動物試驗：收集周邊血B處理後有micronucleus出液後以acridineorange染現之雙核細胞（binucleate色cell）26 測試結果¢資料分析（動物試驗）︰-觀察1000PCEorRET/animal-記錄微核數目-計算PCE/RBC（細胞毒性指標）-陽性反應：統計上之顯著增加且有劑量程度關反應計數微核紅血球傳統方法為用Giemsa染劑染色後配合顯微鏡檢，每隻動物計數1000個多染性紅血球或網狀紅血球，微核率指多染性紅血球或網狀紅血球中微核發生的數目，以千分率表示。改進方法為採用Acridineorange染劑染色後配合螢光顯微鏡檢，可以觀察網狀紅血球中微核的發生率，取代多染性紅血球，唯此法仍需大量人員工時，不易大量推廣。特別是當毒藥物引起骨髓及周邊血液之網狀紅血球數目減少時，人工計數法便相當耗時，往往成為毒性試驗專責機構服務績效的一個瓶頸。27 結語¢明顯之染色體變異通常容易觀察與偵測，例如deletion，但細胞可能無法存活，因此較不具生物關連性與判斷其長久之影響¢不易偵測之細微染色體變異，例如translocation或inversion等，可能對健康有更大之影響¢未來發展也許可條紋染色（bandingstain）或利用螢光雜交技術（FISH），以不同顏色之螢光標記標識DNA探針，偵測到染色體之多種變異28 結語¢基因毒性綜合測試法(包括體外與活體)因實驗條件會導致假陰性或假陽性反應，所以即使基因毒性試驗結果呈陽性反應，不一定表示試驗物質會對人體產生基因毒性或致癌性(反之亦然)。因此以上的基因毒性測試方法只能提供基本的基因毒性資訊，應依試驗物質的性質加入其他的基因毒性測試方法¢若試驗物質在體外測試系統中呈陰性反應，則只須進行一種動物活體基因毒性測試¢若試驗物質在體外測試系統中呈陽性反應，則須進行動物活體基因毒性及骨髓或血液以外的組織進行更多活體測試，以便獲取進一步的資訊。¢若活體與體外測試的試驗結果不一致時，則須依個案加以解釋。29