lsv 16kdatgb1抗血清制备及rna沉默抑制子的鉴定

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2、Y3057967’——大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目：LSy!鱼迪型!鱼!擅鱼溘剑垒丞巡江魅控剑壬鲍鉴定作者签名：堕遮日期：鱼丛年—厶月—卫日万方数据大连理工大学硕士学位论

3、文摘要百合无症病毒(三itysymptomlessvirus，LSV)是香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)中的一种，能够严重危害百合种球质量和鲜切花品质，是侵染百合的三大病毒之一。病毒为单链正义RNA，含有6个开放阅读框(ORF)，编码4个蛋白，依5’至3’分别编码：RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，三基因连锁运动蛋白(TGBl．3)，外壳蛋白(CP)和未知功能蛋白(16kDa)。本研究以感染LSV的百合叶片为试材，通过RT．PCR克隆LSV基因16kDa。将该基因连接至原核表达载体pET．28a(+)，重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)

4、，IPTG诱导表达并通过SDS．PAGE及质谱分析，证明得到高效表达的16kDa融合蛋白，蛋白以包涵体形式存在。经镍柱纯化后得到纯度较高的蛋白。将纯化蛋白16kDa和TGBl分别作为抗原免疫小鼠，制备16kDa和TGBl蛋白抗血清，间接ELISA检测抗血清效价较高。通过Westernblot分析，制备的特异性抗血清能与16kDa，TGBl以及百合叶片总蛋白反应，均出现目的杂交条带。制备的抗血清可用于病毒检测、蛋白质印迹、免疫组织化学等方面的研究。为了验证LSV是否编码RNA沉默抑制子来干扰植物RNA沉默，以16kDa和TGBl为研究对象，分别构建TGB

5、l、16kDa和16kDaA的pMDaMl8．T载体，测序正确后连至双元表达载体PTFl01．1，将获得的重组质粒通过农杆菌共浸润到转GFP本氏烟16c。将TGBl、16kDa分别构建至双元表达载体pGRl07，侵染普通本氏烟。结果表明：16kDa蛋白能抑制由GFP介导的局部沉默和系统沉默，其抑制作用较弱；能逆转系统沉默；不能抑制由dsRNA引起的局部沉默；TGBl蛋白无抑制沉默功能。实时定量PCR和Westernblot也证明了上述结果，即16kDa是LSV编码的RNA沉默抑制子。另外，TGBl和16kDa均不能加重PVX病毒的症状，证明有些抑制子不

6、会与PVX病毒协同作用。将含有PTFl01—16kDa／TGBl质粒的农杆菌分别侵染烟草和百合，提取烟草和百合线粒体的总蛋白，Westernblot检测证明16kDa和TGBI都位于线粒体上。免疫胶体金电镜观察发现16kDa和TGBl金颗粒在叶绿体中，但含量极少。以上结果表明：16kDa和TGBl主要作用于细胞线粒体中，对叶绿体影响有限。综上所述，本研究通过LSV编码蛋白TGBl和16kDa功能分析，初步判定16kDa蛋白具有RNA沉默抑制子功能。16kDa和TGBl主要定位在细胞线粒体上。因此可以推断，受百合无症病毒侵染植株外部症状不明显，无致病性，

7、可能16kDa和TGBl蛋白主要受体不是叶绿体，而是线粒体。关键词：百合无症病毒；16kPa；TGBl；抗血清制备；沉默抑制子；亚细胞定位万方数据LSV16kDa／TGB1抗血清制备及RNA沉默抑制子鉴定AntiserumPreparationandIdentificationofRNASilencingSuppressorofLSV16l(Da／TGBlAbstract三咖symptomlessvirus(LSV)isbelongtocarlavirus，whichisoneofthethreevirusesinfectinglilyanditCan

8、influencethequalityofbulbandfreshlycutflowerbadly．negenomeof，咖symptomlessvirusiSsingle．strandedpositiveRNAmoleculewhichcontainssixopenreadiIlgframesanditCanencodefourproteinsfrom57to37：RdRp。TGB1-3，CPand16kDa．11忙leavesoflilywhichwereinfectedLSVwereusedtocloneLSV．『酣ZI口byRT-PCRinth

9、estudy．11lefragmentWaSligatedwithexpressionvect