RNA的制备及纯度的鉴定

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1、生物制药09303第七组指导老师：陈芬（一）操作方法6.思考问题5.注意事项4.工艺过程3.仪器试剂2.基本原理1.背景知识RNA的制备及纯度的鉴定背景知识核糖核酸，简称RNA，主要以单链的形式存在于生物体内,其高级结构很复杂,它们既担负着储藏及转移遗传信息的功能,又能作为核酶在细胞内发挥代谢功能。生物体内共有三种RNA，即编码特定蛋白质序列的信使RNA；能特异性解读mRNA中的遗传信息、将其转化成相应氨基酸后加入多肽链中的转运RNA；直接参与核糖体中蛋白质合成的核糖体RNA。mRNA的选择性拼接合成类RNARNA的生物合成RNA

2、/DNA诊断仪实验目的1掌握从动物组织中提取RNA的基本原理和操作2掌握RNA纯度鉴定的原理和基本操作3进一步熟悉可见分光光度计的使用实验原理细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此分离RNA时必须使RNA与蛋白质解离，并除去蛋白质。最常用含水的酚溶液除去蛋白质，去污剂和酚均能抑制RNA酶活力，有利于制备核酸大分子，以酚水两相系统分离RNA是将细胞或细胞器置于含有SDS的缓冲盐溶液中，加等体积水饱和的酚，通过剧烈振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。实验所用的0.15mol/L缓冲盐溶液系统可使大部分核糖核

3、蛋白解离，在用酚处理时脱氧核糖核蛋白变性；在低温条件下，从水相中除去，这样得到的RNA制品中混杂的DNA量极低•RNA制品继续用氯仿－异戊醇处理，可以进一步除去其中含有的少量蛋白质。最后用乙醇使RNA自水溶液中沉淀下来。•实验所得制品的核酸含量可用地衣酚显色法测定RNA含量 。RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收。RNA在20～250g范围内，光吸收与RNA的浓度成正比。实验器材与试剂器材：乳

4、钵 、磨口具塞锥形瓶(500ml)天平 、 离心机（4000rpm）动物肝脏、紫外可见分光度计、恒温水浴锅试剂：1.SDS-缓冲盐溶液［0.3%SDS-0.1mol/L氯化钠-0.05mol/L，pH5.0乙酸盐缓冲液］称取1.5gSDS，2.92g氯化钠，2.05g乙酸钠溶于水中，用乙酸调至pH5.0，最后定容至500ml。2.含水酚液：使用前将苯酚重蒸(酚的沸点为181.8℃)并用SDS－缓冲盐溶液使其饱和。3.氯仿-异戊醇液：氯仿：异戊醇=24:1(V/V)。4.含2%乙酸钾的95%乙醇溶液。5.75%乙醇，95%乙醇、无水

5、乙醇。6.乙醚7.RNA标准溶液（须经定磷确定其纯度）：取酵母RNA配成200g/mL的溶液。8.地衣酚试剂：先配制0.1%三氯化铁的浓盐酸（分析纯）溶液，实验前用此溶液作为溶剂配成0.1%地衣酚溶液。实验步骤一.实验前的准备mRNA的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定而且广泛存在,因此在提取过程中应严格防止RNA酶的污染并设法抑制其活性。所用的玻璃器皿需要置于干燥烘箱中200.0°C烘烤两小时以上,凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏水冲净。R

6、NA提取流程2克动物肝脏组织加20mlSDS缓冲盐溶液倒入磨口具塞锥形瓶室温剧烈震荡10分钟研碎加同体积含水酚溶液水浴分层并离心得上清液加氯仿异戊醇震荡离心取上清液放置沉淀离心洗涤沉淀离心干燥将RNA溶于蒸馏水离心得粗品加2%乙酸钾乙醇溶液二.实验过程1.取2g动物肝脏组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加20mLSDS-缓冲盐溶液（见试剂1.）使成均浆，倒入磨口具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚溶液，室温下剧烈振荡10分钟。2.置冰浴中分层，在0-4℃下，以4000rpmn离心15分钟。吸出上清液，加等体积氯仿－异戊醇，室温下剧烈振荡

7、10分钟，以4000rpm离心5分钟，或在室温下放置10分钟使分层。吸出上清液（若有必要，该操作可反复多次），加2倍体积2%乙酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置1小时使RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。3.若要得到干燥制品，可将沉淀液以4000rpm离心10分钟，倾去上清液。沉淀用少许75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇各洗1次，同上法离心，倾去乙醇后，空气干燥。4.将RNA（准确称取30mg左右RNA干燥制品）溶于5～10mL蒸馏水中，离心除去不溶性杂质，得RNA粗品。5.RNA纯度的鉴定一、RNA标准曲线的制定取8支试管，编号

8、，按表加入试剂。加毕，摇匀，置沸水浴中加热15min，冷却，测OD670值。以OD670值为纵坐标，RNA含量（ug/ml）为横坐标绘制标准曲线。二、制品的测定取0.2~0.5ml制品液于试管中，加蒸馏水稀释至2ml，然后加2ml地衣酚试剂摇匀，