不同rna沉默抑制子对马铃薯x病毒载体表达的系统作用的研究硕士论文

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1、摘要植物RNA病毒载体表达体系是在植物中生产外源蛋白的一种有潜力的平台，病毒诱导的基因沉默(Virusinducedgenesilencing，VIGS)是目前此类表达系统表达量普遍偏低的根本原因。在植物和病毒长期的互作中，病毒可通过自身编码RNA沉默抑制因子(RNAsilencingsuppressors，RSSs)来抑制VIGS反应，因而认为RSSs具有提高外源基因在植物中表达水平的作用。但是不同RSSs的作用效果以及不同类型RSSs组合是否具有协同作用等问题尚无明确的答案。此外，马铃薯x病毒(PotatoHrusx，PVx)表达载体PVXdt是一种生物安全性、表达量和应用潜力

2、高的新型病毒表达载体，为其寻找适合的“RSSs伴侣”具有重要的现实意义。基于此，我们构建了7种类型8个植物病毒编码的RNA沉默抑制子表达载体，利用农杆菌渗滤技术与PVXdt病毒表达载体共接种寄主植物本氏烟草(Nicotianabenthamiana)，通过对病毒载体表达的报告基因绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)的定性和定量分析，期望在探讨上述问题的同时，也为PVXdt寻找到合适的RSSs伴侣。通过TimeCourse实验证明与PVXdt共接种后的第5天是寄主基因沉默与RSSs反沉默相互作用的起始时间，也是RSSs作用效果评价时间。RSSs与PV

3、Xdt共表达实验结果表明，RSSs对共接种病毒载体PVXdt介导的外源蛋白表达确实有增效作用，这种增效作用是通过RSSs抑制寄主基因沉默来实现的；不I同RSSs的增效作用强弱和作用持续时间长短显著不同，TBSV-P19的增效作用最强(最高7倍左右)且持续时问最长(25天)，而ACMV-AC2并HRYMVTEV-P1几乎无增效作用；确定TBSV-P19是PVXdtN毒表达载体的一个合适的RSSs伴侣。RSSs组合实验结果说明，部分组合样品确有协同作用。初步推测，作用机制相似的RSSs组合无协同作用，作用机制不同的部分RSSs组合能产生一定程度的协同作用。在上述研究结果的基础上我们还对

4、RSSs伴侣选择的原则和RSss组合协同作用进一步研究策略等问题做了深入讨论。综上所述，本研究对目前RSSs研究中存在的部分问题进行了初步探索，也为PVXdt病毒载体寻找到了合适的RSSs伴侣TBSV-P19。研究结果对于深入了解RSSs作用效果，加深植物RNA病毒表达载体系统的了解和今后指导具有商品化和工业化生产前景的外源基冈表达奠定坚实的理论基础。关键词：马铃薯x病毒；基因沉默；RNA沉默抑制子；病毒表达载体；共表达AbstractPlantvirusRNA．basedexpressionvectorsystemisanewpotentialplatformforproduci

5、ngproteininplant．Theproductionofexpressionsystemsisloweranddidnotreachtherequiredstandardofindustrialproduction．Theresultofthisphenomenonmaybecausedbyvirusinducedgenesilencingwhichisanevolutionarilyconserveddefensemechanism，itplaysakeyantiviralroleinprotectingplantsagainstvirusinfection．Plantv

6、irusesovercomehostantiviralsilencingbyencodingdiversesuppressorsofRNAsilencing．Priortotheidentificationandcharacterizationoftheirsilencingsuppressionactivitiesmostlyintransgenesilencingassays，plantRSSswereknowntoenhancevirusaccumulationintheinoculatedleaves．PVX-basedexpressionvectors1Sanewviru

7、sexpressionvectorwhichhasbiologicalsafety，expressionandapplicationpotentialvector·Basedonthisdiscovery,weconstructedsevendifferentsuppressorsvectors，thosevectorsweredeliveredintoTobaccoplants(Nicotianabenthamiana)usedagrobacterium‘media